IVD前沿丨数字定量PCR可同时进行多重miRNA和蛋白质检测

在本篇研究中，作者开发了基于微流控数字定量PCR (dqPCR)系统，通过使用单一的生物化学检测方法，在多重检测中同时定量miRNA和蛋白靶标。这种简化的分析是通过在微流控阵列平台中整合碱基堆叠PCR和免疫PCR实现的。let-7a (miRNA)和IL-6(蛋白质)的分析首先分别进行了优化，以确定适合这两种生物分子的热循环和捕获条件。单重dqPCR研究显示了两种分析物在一定浓度范围内的预期数字信号和定量循环。然后，仅使用标准PCR试剂，对let-7a和IL-6进行了高灵敏度(LODs ~ 3 fM)、宽动态范围(5 ~ 5000 fM)的多重分析。然后将该多重dqPCR转化到HEK293细胞裂解液的分析中，在不进行样品纯化或预处理的情况下，同时检测内源性let-7a和IL-6^[1]。

miRNA分析珠(淡红色)用guides DNA(蓝色)预先功能化。从样本中捕获目标miRNA(橙色)并作为BS-dqPCR的模板。通过编码染料(红色)和捕获抗体(紫色)对蛋白质分析微球进行预功能化。将目标蛋白(深绿色)捕获到微球上，然后用二抗(浅蓝色)标记，二抗与适合免疫- dqPCR的DNA标签(淡绿色)结合。两种捕获微球混合与生物样本孵育，然后随机载入微孔阵列中。同时进行BS-dqPCR和免疫- dqPCR，采用单一检测生产化学方法分别检测目标miRNA和蛋白。最初含有目标分析物的微孔在PCR后显示出高荧光(明亮的绿色)。

微孔阵列芯片照片

本研究团队2022年也报道了一种高灵敏度的数字定量PCR (dqPCR)技术，该技术以数字PCR (dPCR)模式进行定量PCR (qPCR)检测^[2]。这个基于微孔阵列的平台最初是为了确定脂质纳米颗粒(LNPs)中DNA载量的异质性而开发的。以dPCR维度分析LNPs以确保捕获单个LNO的捕获，而qPCR维度量化单个LNPs内包装的DNA分子的数量。之前的这些证明突出了dqPCR的优点，但迄今为止，尚未证明可以在一次检测中分析蛋白质，也未证明可以对多种生物分子进行多重检测。研究人员开发了一种在相同的微流控dqPCR平台中分析miRNA的方法。通过碱基堆叠dqPCR (BS-dqPCR)实现无逆转录扩增，对miRNA进行数字和模拟定量。

然而，dqPCR具有满足这些需求的潜力。作者之前已经证实，只使用DNA聚合酶就可以用BS-dqPCR分析miRNA。假设这种分析与免疫PCR分析蛋白质相兼容。免疫-PCR采用与ELISA相似的方案，在捕获抗体、靶蛋白和二抗之间形成三明治复合物。但与ELISA不同的是，ELISA需要与酶进行额外孵育才能产生信号，而免疫PCR中的第二抗体是预先与DNA标签偶联的。PCR扩增该DNA标签，检测原目的蛋白。原则上，在一次多重检测中，使用BS-dqPCR和免疫- dqPCR分别分析miRNA和蛋白质时，只需要一个酶(即DNA聚合酶)。

开发一种同时定量miRNA和蛋白靶标的方法提出了一个重大的分析挑战。一组分析条件必须适用于测量这两类生物分子，而不牺牲其中任何一类的性能。

首先评估的是样品孵育缓冲液。核酸检测通常将目标分析物与SSC缓冲液中的探针杂交，以减少核酸之间的静电排斥。相反，蛋白质测定通常使用含有低百分比BSA的PBS缓冲液，以减少非特异性结合。初步的dqPCR实验评估了PBS, SSC和BSA如何影响let-7a和IL-6的捕获。之前的工作中开发了采用冷-长启动的不对称PCR热循环程序，该程序在本研究中用于蛋白质和miRNA靶点。对IL-6的分析发现，缓冲液的选择不影响测定，因为数字信号在不同条件下是一致的，下图A；然而，当在PBS中孵育时，Let-7a捕获显示出数字信号的大幅减少，下图1B。BSA的加入加剧了上述问题，因为信号进一步降低。因此，所有后续实验均使用1× SSC/0.1% Tween 20（反应体系对miRNA和蛋白同时定量检测至关重要），而不使用BSA作为捕获缓冲液。

影响miRNA捕获的另一个关键因素是结合在微球上的guide DNA的数量。在BS-dqPCR中，guide DNA被用作PCR模板，当目标miRNA结合时进行扩增。为了实现有效的BS-dqPCR，必须在微孔中存在足够数量的guide DNA。然而，过多的guide DNA会在没有miRNA存在的情况下导至非特异性扩增，因为正向引物和导板之间的瞬时结合事件可能会延长。

通过优化捕获缓冲液、温度和引导数，我们试图表征BS-dqPCR定量miRNA的能力。Let-7a与磁珠孵育1 h，浓度范围为0 ~ 5000 fM。较低的miRNA浓度产生数字信号，表明在单分子状态下工作，而较高的浓度使数字阵列饱和，因为所有微孔都变得活跃。唯一的限制是5 fM校准标准与空白使用这1小时捕捉时间是不可区分的。然后使用2 h捕获生成第二校准曲线以提高灵敏度（下图橙色圆形）。

有趣的是，更高的灵敏度导至500fM信号的数字信号饱和，与5000fM校准标准无法区分。通过引入qPCR来克服dPCR信号的饱和情况（下图黑色菱形）。这些结果表明，1小时和2小时捕获均为miRNA分析提供了定量浓度依赖性反应，并且根据所需的敏感性，这两种时间均可用于后续研究。此外，通过采用dPCR和qPCR两个维度，可以扩大检测的动态范围。

在建立了最佳的miRNA分析条件后，对IL-6蛋白进行了免疫- dqPCR分析。实验比较了BS-dqPCR所需的标准PCR和非对称PCR程序的免疫dqPCR性能。阳性对照和阴性对照的数字信号相似。这些结果表明，冷-长启动和不对称的冷循环程序成功扩增了免疫pcr DNA标签，而没有增加假阳性率或牺牲真阳性率。此外，利用与BS-dqPCR相同的PCR引物检测miRNA也取得了良好的性能。

通过实验确定了最佳的检测抗体浓度和洗涤缓冲液组成。为了保持与miRNA分析维度的兼容性，阳性对照(100 fM IL-6)和阴性对照(0 fM IL-6)在1× SSC/0.1% Tween 20中在35℃孵育。在初始孵育后，在25℃下，将不同浓度的检测抗体分别与1× SSC/0.1% Tween 20或1× PBS/0.1% Tween 20/ 0.1% BSA孵育。在SSC中孵育的珠子用5× SSC/0.1% Tween 20洗涤，在PBS中孵育的珠子用5× PBS/0.1% Tween 20洗涤。本研究结果表明，阳性和阴性对照的数字信号均随着检测抗体浓度的增加而增加。

在0 ~ 5000 fM范围内制备IL-6标准品并测量数字信号。正如预期的那样，在校准范围内观察到泊松反应，LOD为1.8 fM。

多重miRNA和蛋白质分析

Let-7a和IL-6被组合成一个样品，并与两种分析物的磁珠孵育。在初步研究中，很快观察到两种不同的珠群在孵育期间聚集，这导至珠无法装入微孔中。增加表面活性剂(吐温20)的量或将封闭BSA添加到孵育缓冲液中并不能缓解这一问题。因为，聚集可能是由于链霉亲和素的结合相互作用。处理方式：使用生物素对两个珠群进行预洗涤，然后在含有生物素的捕获缓冲液中将珠团混合在一起。这种方法通过用生物素饱和珠上的游离链亲和素位点，成功地防止了两个珠群之间的聚集。因此，微球能够混合而没有任何明显的聚集，并易于装入微孔中。

解决了磁珠聚集问题后，评估多重检测的定量效果。产生两条单独的校准曲线，其中一种分析物的浓度在0 - 5000 fM之间变化，另一种保持在固定的高浓度(500 fM)。这种方法被用来评估珠群之间潜在的串扰。本研究的结果表明，两种分析物均表现出定量响应，并在多重格式中保持了较高的灵敏度。

综上所述，这些研究表明，BS-PCR和免疫- pcr的整合实现了一种灵敏和精简的方法，用于miRNA和蛋白质的多重分析，这将使研究人员在未来的应用中更好地了解疾病的发病机制。

参考文献：

[1] Vanness BC, Linz TH. Multiplexed miRNA and Protein Analysis Using Digital Quantitative PCR in Microwell Arrays. Anal Chem. 2024 Jan 23;96(3):1371-1379. doi: 10.1021/acs.analchem.3c05213. Epub 2024 Jan 6. PMID: 38183281.

[2] McCarthy Riley BF, Mai HT, Linz TH. Microfluidic Digital Quantitative PCR to Measure Internal Cargo of Individual Liposomes. Anal Chem. 2022 May 24;94(20):7433-7441. doi: 10.1021/acs.analchem.2c01232. Epub 2022 May 10. PMID: 35536164.