21三体(T21)，俗称唐氏综合症(DS)，是人类最常见的染色体异常。其复杂表型是人类21号染色体（Chr21）基因剂量失衡的结果，影响多个身体系统。T21的发病率在不同人群中有所不同，例如，从1 / 319到1 / 1000活产。1968年，首次对T21进行了产前诊断。羊膜穿刺术（AMC）或绒毛膜绒毛取样（CVS）被认为是最终诊断胎儿非整倍体的“金标准”。然而，这些侵入性手术可能导至高达1%的医源性流产和其他并发症。 筛查方法涉及到母亲的年龄和评估母亲血清生化分析和产前超声检查的组合。妊娠早期和中期筛查结果提供了检出率DR约88-96%。然而，阳性预测值PPV只有3%到5%。近些年，胎儿染色体非整倍体的无创产前检测(NIPT)有了长足的发展。基于下一代测序(NGS)的方法筛查cfDNA具有极好的敏感性和特异性，但该过程耗时、复杂且昂贵。这使得NGS难以广泛应用于临床常规实验室检测。为了克服NGS的这一缺点，液滴数字PCR (ddPCR)可以作为一种替代方法。与NGS相比，该方法更灵敏，需要更少的人工和时间(仅2-3小时)，运行测试的成本也更低。 近日一组来自捷克的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Rapid non‑invasive prenatal screening test for trisomy 21 based on digital droplet PCR”的文章。在这项研究中，作者采用多重液滴数字PCR检测21号染色体16个扩增子和18号染色体16个扩增子（作为参考）。两种荧光标记的锁核酸探针用于检测反应产物。分析了26例整倍体妊娠孕妇和16例21三体妊娠孕妇的血浆cfDNA，以确定样本分类的cutoff值。该测试在一项盲法研究中得到了验证，该研究对30名21三体风险为1:4至1:801的孕妇的血浆样本进行了检测。结果与侵入性诊断程序的结果完全一致(敏感性、特异性、PPV和NPV均为100%)。 图片来源：Scientific reports 主要内容 多重ddPCR优化 作者使用了两种荧光标记的锁核酸LNA探针用于检测反应产物。LNA探针对互补DNA具有更高的亲和力，增加了双链稳定性和错配判别。对Chr21的16对引物的LNA探针进行FAM标记，对Chr18的16对引物的LNA探针进行VIC标记。 作者首先对所有引物进行单靶反应测试，并用相应的探针检测扩增子。然后优化了多重检测技术。一些引物被排除在外。引物对被排除的原因有四个:(1)没有扩增目标，(2)扩增的产物量比用其他引物对扩增的产物量高，(3)两个探针检测到了相同的扩增子，(4)用引物对扩增成功，但提高了第二个通道中阴性液滴的荧光（图A）。优化后（图B），选择最终的多重扩增，从每条染色体各扩增16个扩增子。多重ddPCR导至对照个体基因组DNA的比值为Chr 21/Chr 18 = 0.9715，T21个体的基因组DNA的比值为1.4555，从而正确地反映了核型中Chr 21的数量。
多重ddPCR优化结果。图片来源：Scientific reports 人工样本分析 作者用人类女性基因组DNA和人类T21基因组DNA制备了含有20%、15%、10%、5%和0% T21基因组DNA的0.125 ng/µl DNA人工样本混合物。对于每种混合物，在12个重复中进行ddPCR检测，对所有12个重复获得的数据进行合并，并计算不确定性（下表）。在本实验中，如果母体血浆中存在超过5%的胎儿cfDNA，则获得的不确定性似乎足以明确区分T21妊娠。
在人工样本的分析中得到Chr21/Chr18的比值。图片来源：Scientific reports 真实血浆样本分析 母体血浆是分析所需的cfDNA的真正来源。为了观察差异，作者将整倍体胎儿孕妇样本中获得的Chr 21/Chr 18比率与基因组对照DNA（人工样本）中获得的比率进行了比较(下图)。结果表明，通过检测真实血浆样本获得了更高的Chr 21/Chr 18比率。
在真实血浆样本的分析中得到Chr21/Chr18的比值。 图片来源：Scientific reports 孕妇cfDNA分析 根据该阶段的结果建立受试者工作特征(ROC)曲线，确定整倍体妊娠和T21妊娠分类的比值Chr 21/Chr 18的cutoff值。为了获得最大的灵敏度和特异度，选择截止值1.0955。曲线下面积等于0.928，说明该检测方法具有很好的判别能力(图A、B)。使用这个cutoff值，16例T21妊娠中有14例被正确识别。特异性为96.2%，敏感性为87.5%。PPV为93.3%，NPV为92.6%。 该测试在T21风险为1:4至1:801的孕妇的30份血浆样本中进行了验证。使用设置的cutoff值，正确确定了所有检查的妊娠状态(图C)。整倍体和T21妊娠明显区分(图D)。结果与随后的侵入性诊断过程的结果完全一致，所有的测试参数(敏感性、特异性、PPV和NPV)达到100%。
初步研究以及验证研究结果。图片来源：Scientific reports 结果讨论及挑战 验证队列中，有两个T21样本得到的Chr 21/18比率值非常接近cutoff值。造成这种差异的原因可能有两个。第一个可能是使用了不同批次的试剂进行分析，其含量的微小差异可能会影响结果。二可能是由于cfDNA的胎儿比例FF。统计置信度的最小FF通常在2%到4%之间，但许多生物学因素可以影响母体和胎盘的cfDNA贡献。例如，母亲体重过高、母亲自身免疫性疾病或母亲年龄均可降低FF。低FF可能导至结果进入灰色区域，这可能导至测试失败或无确定结果。对于灰色地带的病例，美国妇产科医师学会建议对患者进行全面的超声检查和诊断测试，因为非整倍体的风险会增加。为了避免提前出现“no call”结果，可以使用基于较小片段大小的FF富集方案。另一种选择是对样品进行质量控制，以检测FF。不幸的是，目前使用的测量FF的方法没有标准化，而且差异很大。 在验证阶段，一名胎儿携带18三体(T18)的患者。该患者ddPCR分析后得到的21/18比值低于健康妊娠的第25百分位数。这一结果表明该方法的相反应用，即T18的检测。然而，在将该分析用于此目的之前，有必要建立cutoff值。 当比较试验阶段和验证阶段的结果时，可以看到灵敏度和特异性的差异。这可能是由于验证阶段的样品数量较少或样品的新鲜度不同造成的。血液采集后几天，用于验证阶段的血浆样本即进行检测。然而，用于初试研究的样品在- 20°C下保存了几年。这可能会影响cfDNA的质量和数量，并在最终结果中反映出来。 总结 在这项研究中，作者采用多重液滴数字PCR检测21号染色体16个扩增子和18号染色体16个扩增子（作为参考）。两种荧光标记的锁核酸探针用于检测反应产物。分析了26例整倍体妊娠孕妇和16例21三体妊娠孕妇的血浆cfDNA，以确定样本分类的cutoff值。该测试在一项盲法研究中得到了验证，该研究对30名21三体风险为1:4至1:801的孕妇的血浆样本进行了研究。结果与侵入性诊断程序的结果完全一致(敏感性、特异性、PPV和NPV均为100%)。 此外，低成本和分析速度决定了该方法可以作为一种筛查替代方案实施到临床工作流程中，在侵入性手术前为T21高风险的焦虑患者提供额外的筛查选择。 |
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