大肠杆菌(E. coli)是一种革兰氏阴性菌，是人类和动物肠道中正常的共生菌群，但有些菌株会引起腹泻和尿路感染(UTI)。尿路系统病原体大肠杆菌(UPEC)导至高达90%的尿路感染，被认为是社区和医院尿路感染的主要原因。尿路感染通常难以治疗，并可引起实质损害，导至肾功能不全和其他并发症。有症状的尿路感染患者通常有高浓度的细菌感染，通常在尿标本中检测到≥105 CFU/mL。 金标准实验室诊断通常基于传统的培养方法，鉴定菌落至少需要24小时，用生化和血清学方法确认报告需要5 - 7天。相比之下，基于分子的方法通常表现出更高的敏感性和特异性，例如，聚合酶链式反应(PCR)，但需要昂贵的仪器，成本相对较高。环介导等温扩增(LAMP)是一种用户友好、低成本和简单的方法，只需简单的程序和常见的热控制仪器。因此，该技术对于资源有限地区的护理点环境帮助诊断UTIs是可行和有价值的。此外，由于LAMP的简单性，可以与多种方法和设备相结合，例如磁分离、微流控阻抗传感等，以提高敏感性和可行性。 近日，一组来自泰国的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Validation of quantitative loop-mediated isothermal amplification assay using a fluorescent distance-based paper device for detection of Escherichia coli in urine”的文章。作者成功开发了一种半定量基于距离的纸基装置（dPAD），联合荧光LAMP法，可以在不到2 h的时间内检测到大肠杆菌并进行半定量，而不需要后处理染色过程。作者验证了dPAD联合荧光LAMP法筛选和评估尿路感染患者尿液中大肠杆菌感染水平。该研究提出了一种廉价的替代方法，比金标准诊断更快，便携式，具有成本效益，并且需要的设备简单，特别适合在资源有限地区的各级卫生保健设施到护理点环境中应用。 “ 图片来源：Scientific reports 主要内容 尿样中大肠杆菌感染的荧光封闭管筛选及3种半定量评价方法 在LAMP扩增前使用荧光SYBR，可快速定性筛选LAMP扩增产物（下图1），在扩增后使用dPAD评估和半定量LAMP扩增子（下图2）。 定性筛选可采用荧光封闭管LAMP法，在BL透射仪下肉眼直接观察。为了评估和半定量尿样本中大肠杆菌的感染程度，将封闭管SYBR LAMP法的4µL LAMP反应液移液至dPAD的样品区，等待12 min即可用来观察荧光迁移距离。作者选用3种半定量评价方法：LAMP扩增产物在BL透射仪下直接用肉眼测量迁移距离。荧光的迁移距离与LAMP产物的最终数量相关（dPAD法）。可使用不含基因组DNA的Milli Q水作为阴性对照，与样品的迁移距离差来标准化LAMP扩增产物的迁移距离（ΔdPAD法）。在荧光封闭管LAMP法显示阳性结果后，再使用dPAD半定量LAMP扩增产物的迁移距离（荧光封闭管联合dPAD法）。
“ dPAD荧光LAMP法筛选和定量评价尿中大肠杆菌的示意图程序。图片来源：Scientific reports dPAD在尿样品中大肠杆菌感染筛选和定量中的应用 作者将dPAD、ΔdPAD和荧光封闭管联合dPAD法来半定量尿液样本中的大肠杆菌，样本感染情况可分为三个级别:重度(11.74±1.14毫米, 6.35±0.52 毫米, 11.74±1.14毫米)，轻度(8.65±0.54毫米,4.37±0.55毫米,9.17±0.51毫米)和无(6.95±0.72 毫米、1.27±1.09毫米、7.57±1.01 毫米)(如下图)。图a为dPAD，图b为ΔdPAD，图c为荧光封闭管联合dPAD，图d为qPCR结果。对于两种单一检测方法(dPAD和ΔdPAD)和一种联合检测方法(dPAD与荧光封闭管联合)，三个级别之间的荧光迁移距离有显著差异。然而，在ΔdPAD和qPCR中，重度感染水平和轻度感染水平之间的荧光迁移距离没有显著差异。 在UTI患者中，qPCR和dPAD以及荧光封闭管联合dPAD法对重度感染患者感染水平的评价是一致的。然而，在轻度感染中，dPAD迁移距离存在错误读出。ΔdPAD敏感性降低至81.0%，但特异性增加至95.5% 。荧光封闭管联合dPAD法，获得了最高的敏感性。该方法可以半量化和评估重度、轻度和无尿路感染患者中大肠杆菌的感染水平。
“ 不同检测方法（dPAD、ΔdPAD、荧光封闭管联合dPAD法以及qPCR）的比较。图片来源：Scientific reports dPAD半定量LAMP检测的敏感性和特异性评价 从尿中提取了440份DNA样本以评估和验证dPAD LAMP定量检测方法。以常规培养法为金标准，荧光封闭管联合dPAD法的敏感性和特异性为100.0和92.7% (如下表)。荧光封闭管和dPAD两种单一检测方法的敏感性为100.0%；qPCR和ΔdPAD敏感性91.7%和81.0%。荧光封闭管、qPCR和ΔdPAD的特异性较高，分别为93.0、93.8和95.5%；但dPAD特异性较低，为56.2%。 荧光封闭管、qPCR和荧光封闭管联合dPAD法与金标准常规培养相比，结果几乎完全一致，而ΔdPAD一致性中等，dPAD一致性较差。
“ dPAD LAMP法检测UTI患者尿液中大肠杆菌DNA的敏感性和特异性。图片来源：Scientific reports 不同大肠杆菌检测方法诊断患者UTI的特点比较 由于对非昂贵仪器的要求，dPAD结合荧光封闭管LAMP检测对当地卫生服务中心来说既方便又负担得起，经验不足的技术人员也可以使用逐步操作程序进行检测。反应混合物的成本在PCR和LAMP每个反应约为4.5美元，而qPCR的成本约为5.5美元(如下表)。LAMP检测需要一个简单的加热装置，这比PCR相对便宜，尤其是qPCR。最后，dPAD联合荧光封闭管LAMP法可在3 h 12 min内检测尿路感染患者尿液中大肠杆菌的感染水平，比常规培养法(> 24 h)快7.5倍，成本比qPCR低1.4美元左右。 本研究中利用荧光LAMP封闭管联合dPAD，相对简单，具有较高的敏感性(100.0%)和特异性(92.7%)。并且可以选择性地在一步LAMP检测中同时进行定性筛选和半定量评估，而不需要先进的仪器。然而，该检测需要一个透射仪来激发荧光，作为快速筛选和半定量UTI诊断感染水平的代价。在简化重度感染、轻度感染和非感染状态的检测方面，这种方法仍然有限制。然而，它仍然足以在各级卫生保健设施中建立，特别是在资源有限地区的现场诊断到护理点环境中，因为该分析可靠、快速、简单、廉价和实用。
“ 不同大肠杆菌检测方法诊断患者UTI的特点比较。 图片来源：Scientific reports 总结与讨论 有症状的尿路感染患者通常有高浓度的细菌感染，通常在尿标本中检测到≥105 CFU/mL，其中培养法通常是金标准诊断。本研究验证了一种简单廉价的基于距离的纸装置(dPAD)联合荧光封闭管LAMP法同时筛选和半定量440例尿路感染患者尿液样本中的大肠杆菌感染水平。dPAD可以检测LAMP扩增子，并对重度感染(≥104 CFU/mL)、轻度感染(≤103 CFU/mL)和未感染的大肠杆菌感染水平进行半量化。与荧光封闭管+ dPAD联合检测方法(敏感性和特异性分别为100.0和92.7%)相比，单一定量检测方法ΔdPAD的敏感性(81.0%)和dPAD的特异性(56.2%)较低。一步LAMP法可在3 h内完成，比培养法快7.5倍。为了实现尿路感染的早期诊断和快速治疗，这种廉价的dPAD工具与荧光闭管LAMP检测相结合，简单、可靠、快速，便携，特别是在资源有限的地区，可以在各级卫生保健设施中设置。因此，dPAD联合荧光闭管LAMP检测是一种很有前景的快速方法，可以促进UTI的早期诊断，促进合适的快速治疗，从而降低严重程度并预防疾病进展。 |
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