全外显子组测序(WES)工作流程标准化对精准肿瘤学的价值

图片来源：npj Precision Oncology

来自30名患者的肿瘤和配对正常DNA样本在4个ZPM实验室进行WES检测，随后在5个ZPM生物信息学机构进行数据分析(如下图)。DNA最初来自新鲜冷冻样本，这些样本已在德国DKFZ/NCT/DKTK MASTER项目中进行WES分析。该队列涵盖了多种癌症类型，和多种分子改变。所有的DNA样本都由参与中心利用本地化的富集试剂盒、测序仪、和湿实验室方案进行分析。对每个样本QC结果显示，中靶率(目标区域的碱基百分比)为41-83%，平均覆盖率为56 - 504x。并对预定义的494个肿瘤相关基因进行了一致性分析。

研究设计概述

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五个参与机构共进行了960个体细胞突变判读，其中包括804个单核苷酸变异(SNV)和156个缺失/插入。突变判读对应270个独特突变，其中141个(52%)突变被所有5个机构检测到，59个(22%)独特突变被2到4个机构检测到（疑似假阴性），70个(26%)变体被单个机构检测到（疑似假阳性）(下图a)。

对假阴性突变进行深入分析，其中23个(21%)的VAF < 10%或覆盖率< 100(橙色)。剩余的遗漏(34%)是由于不同的filtering程序，包括quality，PASS和其他过滤器。此外，22个(20%)变体被识别，但注释为其他变异的一部分。只有13%变体被遗漏是由于技术问题。假阳性突变中(蓝色)，30个(43%)变异的VAF < 10%， 4个(6%)变异的覆盖率< 100。10个(14%)变异是剪接位点突变，但被错误归类为选择性剪接。此外，10个(14%)插入/缺失仅有单个机构检测到。其余的变异有的在启动子区域，有的由于胚系变异假阳性，有的由于LOH事件。

作者使用至少三个机构检测到的变异共识清单(consensus 3x)对机构的表现进行了评估(下图b)，PPA为91-95%之间，PPV在82-95%之间。对偏差的解释包括低VAF或覆盖率、不同的注释和不同的过滤协议。

不同机构间体细胞突变检测的一致性

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作者根据OncoKB，证据等级1-4对可用药基因的变异进行了深入分析。在17个可用药基因变异中，所有5个机构检测到16个变异(下图c)。样本26中的NF-1变异由三个机构报告，而两个机构将其确定为结构变异。样本14中的ATM突变仅被一家机构检测到。作者还将检测到的变异与DKFZ/NCT/DKTK MASTER项目中报告的治疗相关变异进行了比较。34/36(94%)个变异被所有机构检测到，其余两个变异只被一个机构遗漏。

比较每个机构检测到的治疗相关突变

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基因组区域被分类为(i)精确匹配（下图a，绿色），(ii)考虑基因组duplication后匹配的区域（紫色），以及(iii)不匹配区域（红色）。总结所有30个肿瘤的结果，76%的基因组区域完全匹配或考虑基因组duplication后匹配，而24%的基因组区域拷贝数不匹配。当使用相同的生物信息学管道重新分析了所有测序机构的数据时，结果几乎没有改善，可以得出结论，湿实验室变异性以及肿瘤纯度是观察到的机构间CN变异性的主要贡献者。

CNA判读的机构间一致性 

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对至少两个机构检测到的所有高水平扩增(n = 22)和双等位基因以及单等位基因缺失(n = 23)进行了深入分析(下图b)。对于16个(73%)高度扩增的基因，所有机构都报告了高水平的基因扩增。在五个基因中，只有两到四个机构报告了高水平扩增，而其他机构报告的扩增低于高水平阈值。对于剩余的单个基因，有4家机构报告了高水平的扩增，而有1家机构没有报告任何扩增。

所有机构都检测到11个缺失(48%)。一个机构遗漏了7个缺失，而其余5个缺失被两个或三个机构遗漏。对于样本7，ZPM-4机构检测到CDKN2A和CDKN2B基因的缺失，CN = 1，而其他所有机构检测到这两个基因的深度缺失。当使用统一的生物信息学管道进行数据处理时，这种差异仍然存在，这意味着它是由湿实验室变异性引起的。

治疗相关基因扩增和缺失

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30种肿瘤的同源重组修复缺陷HRD评分在不同机构之间有很强的相关性(如下图)。不同机构之间的系统性偏差在- 15%到+9%之间。对于五个肿瘤病例，所有机构一致报告了HRD。对于另外两个肿瘤病例，四家机构一致报告了HRD。在4个病例中，HRD仅被一个机构检测到，一次由ZPM-1检测到，三次由ZPM-5检测到。

30个肿瘤的肿瘤突变负荷TMB评分在参与研究的机构之间具有很强的相关性。深入分析显示，ZPM-5机构的TMB评分存在显著的系统偏差，其TMB评分较其他ZPM机构低9-20%。两个肿瘤被所有机构确定为TMB-high。病例1有一家机构报告TMB-high，其余四家机构报告的TMB接近阈值。其余27例肿瘤均被各机构一致报道为TMB-low。

根据NCT DKFZ/NCT/DKTK MASTER项目，研究队列中的所有肿瘤均为MSS/MSI-L。没有一家机构报告了任何肿瘤的MSI- H。四家机构使用相同的生物信息学工具，导至MSI评分之间的一致性很高。ZPM-1使用不同的生信工具，导至MSI评分与其他机构的相关性较低，但MSI状态一致。

HRD、TMB和MSI分数的机构间一致性

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作者对湿实验室和生物信息学变异进行了区分，结果显示，湿实验室效应和生物信息学效应的中位数标准差(SD)对每种生物标志物的影响都相对较低。对于HRD、TMB和MSI评分，湿实验室程序与生物信息学解释的偏差中位数SD，与相应的cut-off值相比都很小。对于肿瘤纯度，湿实验室差异与生物信息学解释的偏差中位数SD也非常低，但outlier值很高。对于肿瘤倍性，湿实验室差异解释的变异(0.13)和生物信息学变异(0.18)的中位标准差相似。对于一些样品，几种复杂生物标志物均有高度变异性。3个病例显示HRDsum和肿瘤纯度的高变异性。病例28同时在HRDsum、TMB和肿瘤纯度方面显示出高的湿实验室差异性。综上，复杂的生物标志物结果显示高度一致性，但对纯度和倍性估计问题敏感。

生物信息学和湿实验室机构间变异的比较

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作者对临床癌症样本的WES分析进行了多中心比较，涵盖了整个工作流程。这项试点研究旨在评估一致性水平，并确定机构间差异的因素。该研究集中在体细胞突变，CNAs和复杂生物标志物(HRD, TMB, MSI)。体细胞突变的判读高度一致，PPA在91 - 95%之间，PPV在82 - 95%之间。对偏差的解释包括低VAF或覆盖率、不同的注释和不同的过滤协议。CNAs对基因组序列的总体一致性为76%，具有高湿实验室变异性。各机构间复杂生物标志物相关性强，MSI结果完全一致。总的来说，这些数据为WES作为临床级测试的标准化和协调提供了坚实的来源和基础，并有助于未来外部质量评估(EQA)方案的概念化和设计。

该研究有一定的局限性。首先缺乏关于体细胞变异、CNA和复杂生物标志物的基本事实，这些可能被用作与参与机构的结果进行比较的参考。另外，目前的研究使用的是从新鲜冷冻样本中提取的DNA。在分析福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品时，有必要进行类似的研究来评估中心间变异性，因为在FFPE材料中，低置信度判读更难以正确识别。影响结果普遍化的另一个限制因素是所有参与研究的中心都在德国。

根据研究结果，在常规诊断中将WES作为临床测试实施时，应考虑以下几点:(i)尽管湿实验室和干实验室程序不统一，但当前临床相关的变化仍可以高精度和灵敏度识别。(ii)检测到的体细胞SNV和指标具有相当高的一致性，差异主要发生在低覆盖区域的低VAF变异，这是敏感性和PPV下降的主要来源。此外，评估区域的差异、剪接位点和启动子变异的注释以及其他质量或基于注释的过滤标准导至了少数差异报告的变异，这表明需要进一步协调生物信息学管道。(iii)复杂的生物标志物结果显示高度一致性，但对纯度和倍性估计问题敏感。(iv)高水平基因扩增被可靠地识别，但其他CNA(低水平扩增和缺失)更难检测，主要是由于湿实验室的差异，这需要相应的审查。