常用的蛋白分析技术——WB实验操作步骤详解

蛋白样品的好坏，直接决定了能否做出来蛋白条带，所以蛋白样品的提取需严格按照试剂盒说明书进行。

凝胶选择：请根据蛋白分子量的大小，选择合适浓度的分离胶，可参考凝胶配置试剂盒中的说明书，或者参考文献。配胶的APS需要在4° 的冰箱中保存。注意，配胶的时候，胶一定一定要混匀。配胶的试剂中，APS与TEMED是促凝剂，所以在加促凝剂之前，需先把其他组分混匀。

操作：将配置好的分离胶沿着玻璃板一侧缓慢打入玻璃板中，这个时候不用担心打入气泡。灌入合适量的分离胶之后，加入适当剂量的ddWater或者无水乙醇封胶。（加入封胶试剂量没有规定，盖住整个分离胶胶面即可）

Marker孔加入5-10μL，其余蛋白总上样量30-50μg.

接上电源后，先用80V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处，成线状，改为恒压120v直至溴酚蓝电泳到凝胶底部，此过程约用时1.5h。

小贴士：根据实验要求可以进行适当调整，蛋白条带较大时，可延长电泳时间；条带较小时，参照预染Marker条带决定电泳时间。电泳开始的时候，开制冰机制冰，为后面的转膜做准备。

接上电源后，先用80V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处，成线状，改为恒压120v直至溴酚蓝电泳到凝胶底部，此过程约用时1.5h。

小贴士：根据实验要求可以进行适当调整，蛋白条带较大时，可延长电泳时间；条带较小时，参照预染Marker条带决定电泳时间。电泳开始的时候，开制冰机制冰，为后面的转膜做准备。

操作步骤

1. 取出凝胶，根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，并裁剪与SDS-PAGE凝胶相同大小的PVDF膜，滤纸应与纤维垫相同大小；

2.PVDF膜用甲醇浸泡1min后，和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中；

3. 按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入湿转电转槽内，黑色板的一面对黑色负极；

4.在转膜槽中加满电转液，开始转膜。（转膜槽置于水中，并放入冰冻结块的冰袋，尽量多放几个冰袋，保证电转一直处于低温下进行。若转膜时间较长，中途温度升高，可更换冰袋）

小贴士：蛋白大小大于140kD条件下，先在电流200mA情况下转膜120min，然后将电流提高到250mA，继续转膜30min。

漂洗

PVDF膜置于回旋振荡器上漂洗1min，重复漂洗2-3次。

封闭

用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。磷酸化蛋白用5%的BSA封闭2h。

一抗孵育

用含5%脱脂奶粉的TBST（检测磷酸化蛋白用含5% BSA的TBST）稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。

洗涤

TBST充分洗涤PVDF膜3次，15min/次。

二抗孵育

用稀释一抗体系相同的稀释液稀释HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温孵育1h。

洗涤

TBST充分洗涤PVDF膜4次，15min/次。

显色曝光

ECL发光液A液与B液1：1混合（现配现用）；

PVDF膜从TBST洗液中取出后，用滤纸吸干水分（一般用干净镊子夹住PVDF膜，让膜的一角接触滤纸）；

将PVDF放置于成像仪上，均匀滴加ECL工作液，排出气泡，开始曝光。

小贴士：先选择自动曝光进行曝光。同一张膜上未曝光出条带的，可选择手动曝光，加长时间再次曝光。