《Nature protocols》:价廉物美的多种核酸提取新流程应用

近日，一组来自斯坦福的研究团队在杂志Nature protocols杂志上发表了一篇题为“An inexpensive semi-automated sample processing pipeline for cell-free RNA extraction”的文章。作者描述了一种低成本、半自动化的流程来提取cfRNA，使用两种商业上可用的、廉价的开源机器人系统之一: Opentrons OT1.0或OT2.0。分离出的RNA质量与手工处理的金标准相当，且在样品通量(+12倍)、时间(-11倍)、成本(-3倍)和有害废物(-4倍)方面也有所改善。该方案可在4.5 h内同时从96个样品中提取无细胞RNA，也可用于许多核酸提取应用。

与许多RNA分离方案一样，处理cfRNA样品可分为三个部分:RNA提取、DNA消化、RNA清洗和浓缩(如下图)。处理过程需要一个机器人系统，可以配置为使用八通道移液器。大多数步骤都是在机器人上完成的。根据系统提示，用户填充试剂，离心多孔板或更换枪盒。样品添加是手工进行的，适应各种样品存储策略。同样，DNAse master mix和洗脱液的添加也是手工进行的，因为这些步骤需要小体积(<15 μL)移液的步骤。通过使用标准实验室设备并在关键步骤与用户进行交互，这种半自动流程简化了样品处理，同时保持了灵活性。

OT1和OT2系统都由驱动x, y和z方向运动的电机组成，并通过设计和3D打印几个部件固定移液器在各个方向上的自由移动和旋转。移液器固定在系统后，就有必要校准OT1和OT2系统，并在系统中记录每个deck及每种耗材的x, y和z位置。有感兴趣的小伙伴们可自行去文章中查看视频链接，在此不赘述。

从1ml血浆中提取cfRNA需要5mL试剂，因此作者选择使用48深孔板与机器人系统交互。使用48孔板处理96个样品需要将样品短暂分成两批，从48个样本中解冻提取cfRNA，然后冷藏分离的cfRNA，同时解冻处理另外48个样本的cfRNA。结果表明分离的cfRNA冷藏1.5小时对最终产量没有不利影响(下图a，右)。

一旦从所有96个样品中提取出cfRNA，所有样品都用DNAse处理以去除残留DNA，然后清洗并浓缩至最终体积为12 μL。总的来说，这个过程需要4.5小时，每个样品在室温(15-25°C)下放置3个小时。作者在流程中没有发现交叉污染的证据(下图b)，且在每个方案的三个独立试验中，手动和半自动方法的表现相当(下图c)。

该半自动化流程允许用户从96个样品中提取cfRNA，并在1d内确认样品质量。作者使用该方案从404个样本中提取了cfRNA。关键质量指标包括只映射到人类基因组的reads，基因的reads数，以及DNA污染和RNA降解两个自定义指标。从所有样品中提取cfRNA并确认样品质量需要27小时(由于收到样品的时间，一个96孔批次的处理时间超过了2天)。为测序准备文库又花了10天时间。总的来说，作者在2.5周内为所有404个样品准备了测序文库，而手动处理样品需要几个月的时间。

与手动方案相比，假设批量为8个样品，半自动并行处理导至样品批量增加12倍，时间、成本和产生的生物有害废物分别减少近11倍、3倍和4倍(下表1)。减少塑料的使用，特别是通过转向基于孔板(而不是单个管)的耗材和减少枪头的使用，主要有助于降低成本和每个样品处理产生的生物有害废物。

与其他可用的半自动或全自动RNA提取和文库制备方案相比，这个方案为那些希望从更大样本体积中提取RNA的人提供了一种补充选择(下表2)。该方案非常适合中等通量(每月102-103个样本)，但不足以购买昂贵完全自动化机器人(每月104个样本)的实验室。

与手动提取相比，半自动化系统的主要优点包括将样品通量提高12倍，将花费的时间、成本和产生的生物危险废物分别减少近11倍、3倍和4倍。半自动系统非常适合进行发现研究的典型学术实验室的需要。尽管半自动化系统要求用户辅助，但其初始成本(0.55万美元)仍然比自动化系统(2-10万美元)便宜得多。该系统的低成本和易于用户级定制可以应用于所需的任何RNA分离。该方案可以很容易地转移到从其他来源(如组织、尿液或其他体液)分离RNA，而变化相对较少。

但半自动化流程并非没有其局限性。OTl系统不允许移液器更改，限制多通道移液器的体积范围。流程中手动执行的三个步骤需要更小的可变体积，这提供了额外的灵活性。例如，手工添加样品很容易适应各种样品存储策略，如微管和基质管。此外，手动添加洗脱液允许用户轻松修改用于每个RNA分离的体积，以匹配他们选择的下游应用。

总的来说，半自动化的样品处理可以在单个学术实验室中经济、快速地进行。转向半自动化的样品处理允许从样品收集到数据生成和分析的无缝过渡，在重复但重要的任务(如样本处理)上花费更少的时间。