化学发光的机制和应用

发光最确切的定义是当分子或原子从释放状态返回到基态时，这些物种发出的辐射。根据激发源的不同，发光现象可以分为光致发光（荧光和磷光），当激发源是来自吸收的光的能量时，化学发光，也就是来自化学反应的能量和生物催化反应的能量[1]。生物发光现象在自然界中广泛存在，并且已经被研究了很多年。生物发光的分析应用相对较晚，是在发现ATP是萤火虫荧光素[2]（图1）的荧光素酶催化发光的辅助因子之后。

图1 | 生物发光

这一观察导至了定量ATP的方法的发展，ATP既可以作为活细胞存在的指标，也可以作为各种酶系统的产物[3]。后来，人们对合成分子产生了相当大的兴趣，这些分子可以被氧化而发生化学发光反应。Eilhardt Weideman（1988）首先发明了【化学发光】这个术语。化学发光反应是指从化学转化中发射出不同强度和寿命的光，其颜色跨越可见光谱[4, 5]（图2）。

图2 | 化学发光反应

化学发光免疫测定（CLIA）在不同的领域获得了越来越多的关注，包括生命科学、临床诊断、环境监测、食品安全和药物分析[6]，因为它的灵敏度高、特异性好、应用范围广、设备简单和线性范围宽。免疫反应是指抗原和抗体之间的识别。由于这些大分子的低扩散率和部位阻断问题，由质量运输和反应动力学控制的免疫反应速率一般都很低。传统的免疫测定总是需要很长的孵化时间，这又导至整个分析需要几个小时才能完成，所以产量和应用范围在很大程度上受到限制[7]。研究人员设计了不同的方法，通过改善质量运输和反应动力学来缩短分析时间。快速免疫测定扩大了CLIA的应用范围。

传统上，免疫测定是以不连续的方式进行的，即每次测定运行一种分析物，需要多次运行才能检测到复杂系统中的所有成分。大量的时间、试剂和劳动力的消耗限制了传统策略的应用。由于多分析物免疫传感系统具有高通量、短时、低消耗和低成本的优点，因此在最近几年非常受欢迎。同时也需要检测低丰度的样品，所以开发高灵敏度的CLIA已经成为一种新的趋势。提高分析灵敏度的主要方法是减少噪音和提高信号。为了减少噪音，总是使用小蛋白来阻断生物传感界面上的活性位点。信号放大技术主要是构建功能化的界面和设计新型的追踪标签[7]。

CLIA是一种根据化学反应所发出的发光强度来确定样品浓度的方法。一般来说，化学发光反应产生的反应产物之一处于电子激发状态，在下降到基态时产生光。从图3中可以看出，除了激发过程外，化学发光中的光发射过程与光致发光中的相同。在荧光和磷光中，电子激发态是通过吸收从最低的单子激发态（S1）或从三子激发态（T1）返回到基态（S0）的紫外-可见光而产生的[8, 9]。

图3 | Jablonski图描述了常见有机分子电子水平和不同的单重和三重状态之间可能的转换

一般来说，化学发光（CL）反应可以由两个基本机制产生（图4）在直接反应中，两个试剂，通常是底物和氧化剂，在一些辅助因子的存在下，反应产生一个产品或中间物，有时在催化剂的存在下。然后产品或中间物的某些部分将形成电子激发态，随后可以通过发射光子而放松到基态。底物是CL，即前体，它被转化为电子激发分子，负责光发射或作为间接CL中的能量转移供体。

图4 | CL的反应类型；P = 产物，f = 发光物质

最流行的CL底物是鲁米诺、隔离剂及其衍生物、吖啶酯衍生物、过氧化物酶和碱性磷酸酶[7]。相反，间接或敏化CL是基于受激物的能量转移到荧光体上的过程[10]。这个过程使那些不能直接参与CL反应的分子有可能将其多余的能量转移到荧光体上，而荧光体又被激发，通过光子发射释放到其基态。所有这些途径导至了CL在固体、气体和液体阶段的大量实际用途[11]。

在化学发光免疫反应中，标记材料的高特异性和检测的灵敏度是非常重要的。传统的酶标签或荧光衍生物的检测极限在10^-14mol之间，因此只能成功地应用于低灵敏度的检测系统。然而，使用现有的发光计，鲁米诺和吖啶鎓盐的检测限大约为10^-18mol，因此与125I检测的灵敏度相匹配，甚至超过了125I的灵敏度[12]。然而，很明显，鲁米诺与蛋白质的结合会极大地影响反应的量子产率。异鲁米诺的衍生物，特别是氨基丁基乙基异鲁米诺（ABEl）的工作证明了这一点，它可以与低分子量的化合物耦合而不损失量子产率[13]，相关分子已经被用作各种类固醇免疫测定的标签，其性能水平与相应的放射免疫测定相当[14]。当氨基己基乙基隔离剂用于标记乙型肝炎表面抗原的抗体时，观察到类似的量子产率损失[12]。

使用吖啶酯衍生物（图5），如DMAE、NSP-DMAE、HEGAE、HQYAE[15）、ZAE[16]等，与鲁米诺衍生物相比有潜在的优势，可以用图6来解释，图中总结了它们的发光反应。

图5 | 吖啶胺酯的衍生物

图6 | 鲁米诺和吖啶鎓酯的化学发光反应

这两个反应都是氧化反应，在碱性条件下发生，尽管在鲁米诺的情况下，绝对需要一个催化剂。这可以是一个简单的过渡金属阳离子，如Mn2+或Ni2+，但也可能是一个复杂的大分子，如辣根过氧化物酶和细胞色素[17]。最受欢迎的催化剂是微过氧化物酶，因为它能在相对温和的条件下产生有效的反应。这种对催化剂的要求使反应容易受到生物样品中存在的材料的干扰，而强大的氧化条件可能导至高背景效应[12]。

相比之下，吖啶胺酯反应所需的温和条件产生的化学发光背景相对较低。此外，反应本身涉及一个氧化裂解，在形成激发产物分子N甲基吖啶酮之前产生一个二氧乙酮中间体（图7）。作为裂解的结果，N-甲基吖啶酮在发光之前就被解离了，这样就避免了相关蛋白的猝灭[15]。

图7 | 化学发光免疫测定反应的机制

通过增加未标记的抗原的浓度来定量抑制标记的抗原与抗体的结合，构成了放射免疫测定（RIA）的基础。两个基本方面使RIA成为近年来诊断和治疗医学中最重要的技术之一。首先，免疫反应的特异性意味着可以在复杂的混合物（如血清）中进行分析。其次，意识到不仅可以对高分子量的蛋白质产生抗体，而且可以对低分子量的化合物如药物和类固醇产生抗体，只要它们与合适的载体相连接。

IRMA是RIA的替代程序，RIA使用相同类型的免疫学反应，但基于不同的原理。RIA技术涉及标记的抗原和未标记的抗原（作为标准品或未知物）对有限数量的抗体结合位点的竞争，而IRMA依靠的是通过与标记的抗体反应将抗原转化为标记的衍生品，然后直接测量该衍生物。IRMA的主要优点是当使用过量的标记抗体时性能最佳，其结果是所有的抗原都被迅速衍生化。这些快速的反应动力学与RIA中的反应动力学形成对比，RIA中的高灵敏度是通过稀释抗体来实现的，结果是可能需要延长反应时间来提供所需的灵敏度。直到最近，RIA和IRMA都依赖于使用125I作为标签。这种同位素是一种中等能量的γ-发射体，半衰期为60天，其检测灵敏度很高，大约为5 × 10^-18 mol[12]。

放射性标签的一个独特优势是定量不受其环境的影响。在非同位素化合物的情况下，这一点并不正确。发光分子很容易被生物液体的成分（如血清）猝灭信号。一般来说，这个问题已经通过使用固相抗体技术来避免了。因此，在信号检测之前，抗体结合的部分可以从潜在的干扰化合物中分离出来并被洗掉。

CLIA比RIA有明显的优势。首先，它们消除了放射性标签的使用以及随之而来的人员暴露于辐射和废物处理方面的担忧。此外，这些检测方法使用的试剂保质期更长，灵敏度更高，运行时间更短[18]。例如，雌二醇RIA使用125I标记的雌二醇，由于125I的半衰期短，保质期只有2个月。

另外，碘化类固醇往往比天然类固醇对抗体有更高的结合亲和力，从而降低了检测的灵敏度。RIA需要1-3小时的孵化时间，然后每管1分钟进行定量，而使用吖啶酯标记的雌二醇的CLIA只需要30分钟的孵化时间，只需要5秒钟进行定量[18]。Avner Hershlag等人2000年（18）报告说，在接受促性腺激素刺激卵巢的患者中，CLIA的雌二醇结果与RIA结果密切相关。然而，在接受口服雌二醇以准备移植冷冻胚胎的子宫内膜的患者中，观察到雌二醇的CLIA和RIA值之间存在明显的不一致。

有一种双位点免疫化学发光法（ICMA）方法（图8），以获得人类促甲状腺激素（TSH）的高灵敏度检测[19]。在这种检测方法中，分析物与标记的抗体和固相抗体依次或同时反应。在这个过程中，固相抗体对标记抗体的吸收是与分析物结合的数量以及样品中分析物浓度的函数。

图8 | 人甲状腺素（TSH）的双位点免疫化学发光检测（ICMA）

在这个过程中，标准品或血清样品（100 µL）与3 mol/mol吖啶酯标记的单克隆抗体（100µL，1.5ng）反应。2小时后，加入固相抗体悬浮液（100µL，50µg），再过1小时后，加入1mL缓冲液，并将混合物离心。再经过一次1mL的洗涤后，注入200μL水以重新悬浮颗粒，然后加入200μL 0.1%（v/v）H2O2在0.1M NaOH中，对与固相相关的化学发光活性进行发光测量。光子计数在2秒内被整合，绑定的计数与存在的分析物的剂量有关。试剂过量方法的使用与高特异性的吖啶酯标签相结合，使其成为迄今描述的TSH最敏感的免疫测定[20]。

Zhang Ming等人2014年[21]比较了CLIA和RIA检测的抗甲状腺球蛋白抗体（抗TgAb）和抗甲状腺过氧化物酶抗体（抗TPOAb）的结果。据报道，用CLIA和RIA检测的患者和对照组的抗TgAb和抗TPOAb的血清水平没有统计学上的明显差异。

Rojanasakul A等人在1994年[22]通过化学发光免疫测定（CLIA）和放射免疫测定（RIA）对8名志愿者在一个月经周期内的血样进行雌二醇、孕酮、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和催乳素的检测。对比结果发现，CLIA得出的LH、FSH、孕酮的平均值较低，但催乳素的平均值比RIA高。两种方法测定的平均雌二醇水平报告相似。两种方法测定的激素值之间有很好的相关性。通过计算，CLIA荷尔蒙测定值可以准确预测RIA值，孕酮、LH、FSH和催乳素的预测率分别为96.6%、93.9%、89.9%和66.0%。

Chen CK等人1996年[23]评估了化学发光免疫测定（CLIA）系统（Immulite，Diagnostic Products Corp，Los Angeles，CA，USA）的性能，并与流行的免疫放射学免疫测定（IRMA）系统进行了比较。在该研究中，分析了158名甲状腺功能被评估的患者和另外158名甲状旁腺功能被评估的患者的数据。促甲状腺激素（TSH）CLIA是一种超灵敏的TSH（us-TSH）测定，与TSH IRMA相比，对低浓度的TSH提供了更详细、更可靠的结果。与游离T4测定相结合，us-TSH测定增强了检测和监测甲状腺功能紊乱状态的能力。完整的甲状旁腺激素（PTH）CLIA检测到较低的血清完整PTH水平，被发现比IRMA更敏感，且与IRMA一样可靠。

Jing Hua等人2005[24]比较了化学发光免疫法（CLIA）、放射免疫法（RIA）和磁性固相酶联免疫吸附法（MSP-ELISA）分别用CLIA、RIA和MSP-ELISA测定人血清和标准样品中甲状腺激素、总T3、总T4、FT3、FT4和TSH的特点。据报道，CLIA、RIA和MSP-ELISA之间在线性和相对性方面没有统计学差异。CLIA在精确性和准确性方面优于RIA和MSP-ELISA。

采用双抗体夹心CL免疫测定检测不同癌症患者血清中的癌胚抗原（CEA）的浓度，该方法得到的结果与RIA方法得到的结果相当吻合[25]。α-胎儿蛋白（AFP）是最广泛使用的肿瘤标志物，可以通过CLIA方法持续测量，用于诊断肝细胞癌[26, 27]。

前列腺癌（PCa）已成为一种最广泛和最顽固的疾病，也是当今老年男性人口中的主要死亡原因之一。Zheng Y等人在2008年[28]开发了灵敏的化学发光免疫传感器来检测PSA。目前大多数PSA检测方法通常基于免疫测定，而CLIA是最广泛使用的读出方式之一，与其他更广泛使用的系统相比，它的优势毋庸置疑，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、时间分辨免疫荧光测定、表面等离子体荧光免疫测定、生物发光免疫测定、电化学和表面增强拉曼散射（SERS）[29]。

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种流行的分析性生物化学试验，它使用固相酶免疫测定（EIA）来检测液体样品或湿样品中是否存在某种物质，通常是一种抗原。在ELISA中，样品中的抗原被附着在一个表面上。然后，在该表面上再涂上一种特异性抗体，以便它能与抗原结合。该抗体与一种酶相连，在最后一步，加入含有酶底物的物质。随后的反应产生一个可检测的信号，最常见的是底物的颜色变化。ELISA技术源于RIA，但对辐射风险的暴露有限。

由于其在灵敏度、速度和自动化方面的优势，化学发光免疫测定（CLIA）在促进临床诊断和预后中检测超微量活性物质的发展方面发挥了关键作用。如今，作为免疫学市场上迅速增长的技术，CLIA已经成为体外诊断（IVD）医疗器械中最重要的成员之一。

有时，由于某些指标在样品中的浓度较低，用ELISA检测其浓度相当困难，如人绒毛膜促性腺激素（HCG）。然而，绒毛膜促性腺激素（CG）的CLIA试剂盒可用于检测，因为其最小检测范围为2.35pg/ml[30]。CLIA和ELISA试剂盒的特点比较：化学发光试剂盒（CLIA Kit）是一种敏感的试剂盒，它使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）作为酶，增强型ECL化学发光系统作为底物试剂[30]。CLIA和ELISA试剂盒的特点比较见表1。

表1 | CLIA和ELISA试剂的特点比较[30]

CLIA已被广泛应用于不同领域，包括环境监测、液相色谱、临床诊断；食品安全、药物分析、免疫和基因探针检测。如今，CLIA代表了一种有效的、多功能的医学分析工具，适用于广泛的应用，因为它结合了发光信号的高选择性和在样品中定位和量化发光的可能性。

CL技术的高检测性和快速性，以及基于微阵列的分析设备的可用性，使得高通量筛选检测的发展成为可能，在这种情况下，对多样品同时进行多分析物检测。因此，越来越多的医学专家和化学家对CLIA感兴趣。然而，CLIA的发展取决于敏感和选择性的化学发光探针的应用。分析灵敏度的提高将可能导至发现新的分析物肿瘤的检测。技术的提高使人们有希望使用纳米粒子作为标签和CL检测来检测血清中的极低浓度[31, 32]。

化学发光免疫测定为一系列基于放射性同位素的分析性免疫测定提供了一个可行的、合理的替代方案。它的可行性已经被证明适用于一系列的分析物，包括高分子量和低分子量的物种。试剂的稳定性及其分析性能对改善和保持高质量的分析性能具有重要意义。最重要的是，基于标记抗体的ICMA技术的发展有可能提高测定的灵敏度。这种技术可能会被证明在检测和监测感染性物质以及肿瘤标志物方面很有价值，因为传统的免疫测定技术在这方面提供的灵敏度不够。