多重PCR分析检测系统：核酸质谱

2023-8-4 17:06| 编辑: 归去来兮| 查看: 1511| 评论: 0|来源: 东源诊断

摘要: 分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料

分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。

按技术原理，可以将上市分子诊断技术大致划分为PCR技术、分子杂交、基因测序、核酸质谱、生物芯片5大类。

核酸质谱，顾名思义是一种能检测核酸的质谱，它是基于MALDI-TOF MS质谱发展起来的一种相较于传统的荧光定量PCR，一代测序和二代测序，它有什么优势呢？

基因检测目前在遗传性疾病，传染病、肿瘤检测和用药指导等中发挥着重要作用，但是这些技术也存在着明显的不足，比如荧光定量PCR，检测通量小，面对多基因多位点的疾病检测时，就如同小马拉大车，心有余力不足！而一代测序耗时耗力，二代测序解决了通量问题，但是耗物，耗钱，耗时更费人。

所以核酸质谱的优势在于成本低，通量大，检测速度快，同时检测多基因多位点不在话下。

核酸质谱是一把高精度的天平，可区分单个碱基的质量差异(G>A>T>C)，而核酸质量又与碱基组成与长度有关，因此在PCR预处理过程中，使用不同方法形成碱基质量有差异的质谱待测物，则可实现核酸分子的不同检测目的。如通过单碱基延伸和分子切割的两种生物化学技术，使得核酸质谱可用于SNP检测和甲基化分析。

(1)SNP检测

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，其在遗传疾病的诊断和筛查以及用药种类及剂量指导等方面有着极其重要的作用。

MassARRAY^®可通过精确区分4种碱基的分子量差异，对SNP进行检测。其在PCR过程中采用了两轮扩增，从而生成了可用于质谱分析的单碱基延伸产物，详细技术原理如下：

①在跨越SNP位点的上下游区域设计一对引物，该对引物的5’端带有10 mer tag(ACGTTGGATG)，其目的是使第一轮PCR引物≥30bp（质谱图峰检测的范围是4500~9000 Da之间，而碱基平均分子量为300 Da，因此对应的核苷酸检测范围为13~30bp，这样第一轮PCR引物即使未能被后面的SAP完全消化，也不会出现在质谱图中）。该过程也可针对不同SNP位点设计成多重PCR，目前单个反应可达10~60重检测。由此扩增出含有SNP位点的第一轮PCR产物，加入虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)去除剩余的dNTP后，为第二轮PCR做准备。

②针对每个靶点，在紧挨其SNP位点处设计一条单碱基延伸引物，并在体系中加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，以第一轮PCR产物作为模板进行延伸，使得延伸引物在SNP位点处延伸一个碱基后即终止，由此每个SNP的等位基因延伸产物仅有末端一个碱基的差异。

③将第二轮PCR产物与树脂混合，通过离子交换去除液体中吸附于DNA片段上的离子，再在系统上进行质谱分析获得图谱，根据延伸产物分子量的不同，于对应各自的分子量位置查看检测峰图。

(2)甲基化分析

在人类基因组中，DNA甲基化一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点），其胞嘧啶会在DNA甲基化转移酶的作用下与甲基基团结合转化为5-甲基胞嘧啶，作为一种重要的表观遗传学标记，在调控基因表达、维持染色质结构以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大作用。

MassARRAY^®可通过对前期酶处理后的产物分析，根据碱基G和碱基A之间16 Da的分子量差异区分出甲基化和未甲基化的C，并利用各自的峰面积计算出该CpG位点甲基化比例，从而估算整个检测片段内的平均甲基化水平，详细技术原理如下：

①通过亚硫酸氢盐反应将序列中未甲基化的C转化为U，而甲基化的C保持不变，由此甲基化和未甲基化的碱基分子量便开始显现出差异。

②使用5’末端带有T7启动子序列的下游引物对目标CpG岛区域进行PCR扩增，形成带有T7启动子的扩增产物，并在扩增后加入虾碱性磷酸酶处理残余dNTP。

③利用T7转录酶对扩增产物进行体外转录，形成与反向序列一致的RNA转录产物，即未甲基化的C最终变为A，而甲基化的C最终变为G。

④在转录产物中加入特异性核糖核酸内切酶，如利用RNase A特异性识别并切割RNA中U碱基3’端的特性，将产物切割成各种带有CpG位点的小片段RNA，形成不同分子量的检测产物。最后不同片段大小的核酸在质谱图上的不同位置显示，而甲基化不同也会形成分子量有差异的峰图。

3.检测流程

Agena Bioscience MassARRAY系统的检测流程采用了自动化高通量操作设计，PCR及延伸反应完成后，可将PCR反应板及SpectroCHIP芯片载入MassARRAY CPM全自动系统，进行样品检测并实现远程数据分析。其检测流程整合了高灵敏度多重PCR→高通量芯片上机→高精确度质谱分析→自动化报告生成，最大限度的降低质谱操作要求，减少手工操作带来的潜在污染及样本操作误差。

我们来看看核酸质谱的应用方向

单核苷酸多态性

人类的好多遗传性疾病是在SNP上的，单核苷酸多态性就是单个的核苷酸序列发生了变异，引起了DNA序列发生了多样性，比例高达1%。它也是疾病易感基因和药物反应差异性的决定因素。所以通过分析SNP的变异位点，提供疾病预测，诊断和提供用药指导等。

目前荧光定量PCR适宜于检测单基因几个位点（2-8个），但是随着医学技术的深入发展，涉及到多基因多位点的疾病越来越多，这时传统荧光定量PCR的不足就会表现出来，工作量大，检测速度慢。而核酸质谱高灵敏度、分离速度快、杂质干扰少等优势，可以一网打尽（如耳聋基因，4个基因20个位点，核酸质谱可以在一个检测孔中解决）。

应用：药物基因组检测、肿瘤易感基因

基因突变

基因突变检测与SNP检测原理相同，区别在于基因突变检测存在的是突变型（发生突变后的样子）和野生型（原来的样子），这一点与SNP的纯合型（比如显性纯合）和杂合型（杂合子）有所区别。图谱峰的面积与样品中分子量所代表的核酸片段含量成正比，故可以通过突变型/野生型的比值确定突变点的比例，可检测到0.5%以上的突变比例，与金标准验证技术符合度＞95%。

应用：肿瘤突变（EGFR突变），耳聋基因筛查，地中海型贫血、代谢综合征、冠状动脉疾病等

DNA甲基化

人类基因组中含有3-5%的胞嘧啶，会在DNA甲基化转移酶的作用下与甲基基团CpG二苷酸的C’5位上，形成一个CpG岛（300-3000bp），这个CpG岛的甲基化水平异常提高，会抑制抑癌基因转录失活或者一些原癌基因被激活。另外DNA甲基化还与记忆缺陷，精神分裂症、抑郁狂躁等复杂疾病有关。

相比较其他方法，核酸质谱的优势就在于可检测低至5%的甲基化水平，特异性好，灵敏度高。

应用：宫颈癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、食道癌、垂体腺瘤等

基因拷贝数鉴定

人类的基因组会出现一段序列缺失或者增加导至序列发生变化而引起产物变化。这种表型上的差异就是拷贝数变异（CNV），CNV涉及的DNA片段大小通常介于1kbp-3Mbp之间，在基因组中分布广泛，其与临床上罕见病、单基因病相关，也与很多肿瘤等复杂病相关。因此对CNV的变异研究，能够对多种疾病并发机制形成新的认知，以更好地指导疾病的分子诊断和新治疗方法的开发。

核酸质谱可以通过SNP的多态性等位基因比例（SAR）检测技术对待检测标本中目标基因的拷贝数进行定量分析。

高通量检测结果验证

美国FDA批准核酸质谱技术作为二代测序的验证平台，以弥补一代测序仪灵敏度不足的短板。高通量测序的检测灵敏度可达1-5%，因此需要相匹配的验证平台，但是一代测序灵敏度低于15%，无法提供有效的验证，因此，核酸质谱作为两者结果差异时的验证平台。

场景一：结直肠癌KRAS基因低频突变

解密遗传变异与肿瘤发生发展关系的研究，质谱肿瘤基因突变检测分析具有成本低、高通量、高灵敏度和特异性等显著优势。

场景二：多呼吸道病毒、多亚型同时检测

巧妙的整合PCR技术的高灵敏度以及质谱技术的高精确度，开创了检测精确度高、重复性强、具有高度自动化、标准化特征的全新检测时代。可以对微生物、病毒以及其他单倍体生物方便快捷的进行分子分型、物种鉴定、变异物种发现及归类等全面分析。

场景三：高血压用药指导

检测到1%-3%突变等位基因，在个体化用药、耐药及新药筛选等临床项目中，可以尽早检出突变，帮助临床医生改善治疗方案。

应用领域小结

1.SNV/INDEL基因型分析：

2.FUSION融合基因检测；

3.CNV基因拷贝数变异分析；

4.超高灵敏度体细胞突变精确分析；

5.液体活检外周血核酸；

6.DNA甲基化定位定量分析；

7.对测序样本DNA的长度和拷贝数进行质控分析。

目前核酸分析所使用的质谱电离技术主要还是采用 ESI 和MALDI。简单来讲，两种电离技术都是软电离，ESI 检测的特点是生物大分子带多个电荷，质荷比范围基本在2000 Da 以下区间，从而能检测几万乃至更大的生物分子；而MALDI 常得到单电荷峰，与飞行时间(TOF)分析器搭配，检测范围可以到几十万道尔顿。

由于生物样品的复杂性，质谱技术还面临着一些挑战和困难。但生物质谱技术是科学研究的有力工具，随着临床实验室对质谱的了解和应用不断的加深，未来该检测平台或可成为规范实验室不可或缺的标准装备。分子诊断技术的应用不仅深化对疾病发病机制分子生物学的基础研究，而且不断扩大了分子诊断疾病的病种，随着人类基因组计划的完成和蛋白质组计划的启动，分子诊断方法将极大地推动现代检验医学的迅速发展，并通过这些基本技术的衍生、联合产生新的分析方法，从而提高分子诊断的特异性、敏感性和准确性，为临床医学诊断和治疗提供更准确的数据和信息。

参考文献

1、中国核酸质谱应用专家共识协作组.中国核酸质谱应用专家共识[J].中华医学杂志,2018,98(12):895-900.

2、许蕴,李赟,张晓丽,徐迹,刘文兰.飞行时间质谱核酸检测技术在临床检测中的应用[J].中华检验医学杂志,2019,42(8):694-699.

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