《自然》子刊：液体活检用于早筛新方法

来源：小桔灯网

作者：动力彩虹🌈

最近开发的几种表观遗传测序技术部分解决了与BS-Seq相关的局限性。例如，氧化亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)可以解决5mC和5hmC，但需求DNA量较大。化学脱氨法TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)也可以测序修饰的胞嘧啶。与此同时，利用酶而不是化学脱氨的方法也得到了发展。ACE-Seq是第一个使用DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)来选择对未修饰的Cs和5mCs进行脱氨，同时使受保护的5hmCs不被转化的技术。同样，EM-Seq在酶脱胺之前利用TET和βGT酶来获得类似亚硫酸盐合并5mC和5hmC的读数。

近日，一组来自宾夕法尼亚大学的研究团队在杂志Nature Chemical Biology上发表了一篇题为“Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution”的文章。在这篇文章描述了如何实现完整的DM-Seq方法来直接对5mC进行单独测序。与TAPS的比较发现了5mC检测的偏差，可能是由于DHU碱基的聚合酶扩增不良。最终，作者发现，使用纳克级DNA，DM-Seq在测序覆盖范围和5mC的准确定量方面优于BS-Seq，有望应用于液体活检和早期癌症检测等。

尽管酶法脱氨方法有希望，但这些方法受到C和5mC都被A3A脱氨这一事实的限制。为了开发一种精确且无损的流程来单独研究5mC，作者设计保护未修饰的CpG，只留下5mC在CpG环境中被破坏，就可以实现直接的5mC检测(如下图)。DM-Seq采用了两种关键的DNA修饰酶：一种是新DNA甲基转移酶，另一种是能够精确区分胞嘧啶修饰状态的DNA脱氨酶。将这些活性与脱氨酶抗性adapter偶联，可以通过测序中的C-to-T转换直接准确检测5mC。

作者还将DM-Seq与新兴的5mC测序技术TAPS进行了比较，意外发现了TAPS会导至5mC检测偏差，从已有证据推测可能是由于TAPS流程中5mC需转变成二氢尿嘧啶(DHU)，而含DHU的DNA链扩增的效率变低，因此降低了其检测5mC的灵敏度。

结果显示，尽管BS-Seq弥补了2.8倍的低文库得率，但DM-Seq在标准化测序文库中仍然比BS-Seq提供更多的信息内容。与BS-Seq相比，DM-Seq捕获的1kb非重叠独特bin至少增加了5.9倍，这表明DM-Seq能够更好地区分基因组关键位上的5mC和5hmC，并且可通过甲基化水平来预测患者的结局。作者进一步的研究还揭示了BS-Seq（5mC+5hmC）和DM-Seq（仅5mC）两个数据集之间存在较强的相关性；因为GBM中5hmC高度缺失，基于这两种方法生成的图谱总体相似。在GBM相关的CpG位点中，DM-Seq报告了61.4%的5mC修饰，与BS-Seq相比低14.3%，表明其可量化具有功能重要性CpG上的5hmC“盲点”。上述结果表明，与BS-Seq相比，通过DM-Seq直接检测5mC能够揭示临床肿瘤样本中具有预后意义的CpG。

在这里，作者描述了DM-seq，一种非破坏性和仅酶的工作流程，可以使用纳克级DNA在单碱基分辨率下检测5mC。DM-Seq采用两种关键的DNA修饰酶:一种新DNA甲基转移酶和一种能够精确区分胞嘧啶修饰状态的DNA脱氨酶，与抗脱氨酶adapter耦合，可以通过测序中的C-to-T转换准确检测5mC。结果发现DM-Seq，不会混淆5mC和5-羟甲基胞嘧啶，揭示了临床肿瘤样本中具有预后重要性的CpGs。因此，DM-Seq提供了一种全酶、无损、可靠和直接的方法来单独读取5mC。作者还在实验中意外发现，TAPS低估了修饰的碱基，这一特征可能归因于DHU的产生。具有高密度顺式DNA修饰的区域可能特别容易出现扩增不足。

研究团队认为DM-Seq的开发突出了目前5mC定位方法的局限性，这是一个至关重要的问题。GBM分析揭示了直接用DM-Seq在特定CpGs上对5mC进行测序可以提供独特的预后信息。可以很容易地想象，将这项技术扩展到稀疏DNA样本的分析，例如用于早期癌症检测的无细胞DNA。由于其非破坏性和无DHU的工作流程，DM Seq也可以与快速发展的第三代测序平台相结合。最终，通过直接定位5mC，而不是修饰的胞嘧啶，DM-Seq可以更好地确定单独5mC的生物学功能。