IVD技术分析｜LAM-PCR

技术介绍

    LAM-PCR的原理是利用线性扩增和磁珠分离来富集载体-基因组连接处，然后在半固体链霉亲和素相上进行双链合成、限制性酶切、连接子连接和指数PCR等步骤，最后通过电泳或测序来鉴定未知的基因组序列。LAM-PCR可以根据不同的载体和基因组选择合适的引物和限制性酶，以提高特异性和灵敏度。LAM-PCR还可以结合下一代测序（NGS）技术，对大量的IS进行高通量和高分辨率的分析。LAM-PCR是一种灵活、可靠、有效的检测载体整合位点的方法。

图源自参考论文1

LAM-PCR有很多应用场景，主要是用于研究基因治疗中的载体整合情况和克隆组成。例如，LAM-PCR可以用于检测患者体内经过基因修饰的血液细胞的克隆动力学和整合相关的副作用，或者评估新型载体系统的整合行为和生物安全性。此外，LAM-PCR也可以用于分析其他类型的整合载体（如转座子、慢病毒载体）或者被动整合载体（如腺相关病毒或者缺失整合酶的慢病毒载体）在宿主基因组中的整合模式。LAM-PCR是一种广泛应用于基因治疗和基因组学领域的技术。

一个基因治疗中使用LAM-PCR技术的例子是：在一项治疗免疫缺陷的临床试验中，研究人员使用LAM-PCR分析了患者体内经过逆转录病毒载体转导的血液细胞的整合位点，以评估载体的安全性和效果。他们发现载体整合位点在基因组中的分布是非随机的，且有一定的偏好性。他们还发现载体整合位点与患者的血液重建和克隆动力学有关，且有可能导至白血病相关基因的激活。通过LAM-PCR技术，他们能够对患者体内的载体整合情况进行全面和精确的分析，以及对基因治疗的长期效果和风险进行预测。

污染问题

LAM-PCR实验中的污染问题是指在分析整合位点时，可能会检测到非目标的DNA序列，导至结果的偏差和不准确。解决污染问题的方法有以下几种：

• 选择合适的限制性酶和引物，以提高LAM-PCR的特异性和灵敏度。

• 使用双条形码策略，以减少整合位点序列之间的碰撞和混淆。

• 使用无限制性LAM-PCR（nrLAM-PCR）方法，以避免限制性酶切引起的DNA片段不均匀和丢失。

• 在PCR反应前，使用酶处理法去除可能存在的微生物DNA污染。

如何解决LAM-PCR实验中的污染问题？

一个基因治疗中使用其他技术的例子是：在一项治疗癌症的临床试验中，研究人员使用寡核苷酸技术（oligonucleotide-based therapy）来阻断癌细胞的生存过程。他们使用一种特殊的寡核苷酸，叫做AS1411，来识别并结合癌细胞表面的核蛋白A（Nucleolin），从而阻止癌细胞的增殖和血管生成。他们发现AS1411能够有效地抑制多种类型的癌细胞，包括肾癌、乳腺癌和肺癌。通过寡核苷酸技术，他们能够对癌细胞进行特异性和选择性的靶向治疗。

基因安全的评估和效果

评估基因治疗的安全性和效果的方法有以下几种：

• 通过临床试验的三个阶段，分别测试基因治疗的安全性、有效性和优势。临床试验需要遵循严格的伦理和法律规范，以保护参与者的权益和健康。

• 通过动物模型和体外实验，预测基因治疗在人体中的作用和风险。动物模型和体外实验可以提供基因治疗的机制和药代动力学等信息，以指导临床试验的设计和执行。

• 通过长期随访，监测基因治疗的延迟效应和不良反应。基因治疗可能会导至基因组的不稳定性、免疫反应或癌变等潜在的后果，因此需要对受治疗者进行长期的观察和评估。

基因治疗的优势有以下几点：

• 基因治疗可以治疗或预防一些难以用传统药物或手术治疗的遗传性或获得性疾病，如囊性纤维化、血友病、癌症和艾滋病。

• 基因治疗可以直接针对疾病的根源，即异常或缺失的基因，从而修复或替换受损的细胞功能。

• 基因治疗可以提高患者的生活质量和生存期，甚至有可能实现根治或免疫。

• 基因治疗可以减少对其他药物或治疗的依赖，从而降低副作用和成本。

• 基因治疗可以利用人体自身的细胞和分子，从而提高特异性和选择性，减少免疫排斥或过敏反应。

产品和服务

• Creative Biogene公司提供定制的LAM-PCR服务，用于分析逆转录病毒载体在宿主基因组中的整合位点，包括线性PCR、磁珠捕获、双链DNA合成、限制性酶切、连接子连接、嵌套PCR、PCR产物纯化和测序等步骤。

• Bio-Rad公司提供了一种用于LAM-PCR分析的PCR仪器，叫做CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System，可以用于快速、准确和灵敏地检测和定量PCR产物，具有高通量和高分辨率的特点。

• Thermo Fisher Scientific公司提供了一种用于LAM-PCR分析的测序仪器，叫做Ion Torrent S5 System，可以用于高通量和高质量地测序LAM-PCR扩增的整合位点序列，具有高速度和低成本的特点。

• Elchrom Scientific公司提供了一种用于LAM-PCR分析的预制凝胶，叫做Spreadex EL1200，可以用于分离和检测不同长度的DNA片段，具有高分辨率和高灵敏度的特点。

分析流程案例

少量位点基于LAM-PCR方法的ISA分析：

• 从受治疗的患者或动物中采集含有转导细胞的血液或骨髓样本，用DNA提取试剂盒提取总DNA。

• 用逆转录病毒载体特异性的引物进行线性PCR，扩增载体-基因组连接处的DNA片段。

• 用磁珠和链霉亲和素结合，捕获带有生物素标记的PCR产物，去除非目标DNA。

• 在磁珠上进行双链DNA合成，用Klenow酶和六核苷酸混合物随机合成互补链。

• 用限制性酶切双链DNA，选择与载体序列不同的限制性酶，以避免切除载体序列。

• 用T4 DNA连接酶将连接子连接到切割后的基因组末端，连接子包含一个生物素标记和一个特异性引物结合位点。

• 在磁珠上进行指数PCR，用载体特异性的引物和连接子特异性的引物进行扩增，生成带有双重生物素标记的DNA片段。

• 用凝胶电泳分离和检测PCR产物，选择适当的长度范围进行切割和回收。

• 用PCR纯化试剂盒纯化回收的DNA片段，用测序引物进行测序反应，可以使用NGS技术进行高通量测序。

• 用生物信息学软件分析测序数据，比对基因组数据库，确定整合位点的精确位置和周围基因。

大量位点基于LAM-PCR方法的ISA分析：

• 使用LAM-PCR技术对载体整合位点进行扩增，得到包含ITR和侧翼DNA序列的扩增产物。

• 使用下一代测序技术对扩增产物进行测序，得到ITR和侧翼DNA序列的测序数据。

• 使用算法对测序数据进行分析，将数据分解成相互独立的子空间，每个子空间对应一个载体整合位点的特征向量。

• 使用聚类或分类方法对子空间进行进一步的分析，根据子空间之间的相似度或差异度，将载体整合位点分为不同的类别或群体。

• 使用可视化方法对ISA分析的结果进行展示，比如使用散点图、热图、树图等方式，显示载体整合位点的分布、关联、多样性等信息。

这套ISA分析流程可以有效地从载体整合位点的数据中提取出有用的信息，帮助研究者理解基因修饰造血重建的生理机制，以及评估载体相关的克隆贡献和插入性副作用。

参考文献：

1.High-resolution insertion-site analysis by linear amplification–mediated PCR (LAM-PCR),

https://www.nature.com/articles/nmeth1103

2.The LAM-PCR Method to Sequence LV Integration Sites,

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27317177/

3.CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System,

https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx96-touch-real-time-pcr-detection-system

4.Ion Torrent S5 System,

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A27700