基于CRISPR/Cas的检测方法通常需要预扩增步骤来提高靶标核酸的浓度，这可能会产生非特异性扩增，延长检测时间，并增加气溶胶污染的风险。因此，已经开发了各种基于CRISPR/Cas的靶标免扩增的检测策略，旨在最大限度地减少由于缺乏预扩增而导至的灵敏度损失，并促进其在便携式设备中的集成。2022年8月，上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院殷堃团队在Chemical Society Reviews杂志发表了题为：Amplification-free
CRISPR/Cas detection technology: challenges, strategies, and
perspectives 的综述论文。该论文首先总结了基于CRISPR/Cas的靶标免扩增检测的现状和面临的挑战，然后重点介绍了促进靶标免扩增CRISPR/Cas技术性能的4大策略：优化CRISPR/Cas反应的关键参数、采用数字化灵敏检测平台、偶联其它更加灵敏的信号传感器、设计级联反应实现输出信号放大（图1）。最后论文进一步讨论了免扩增CRISPR/Cas检测技术的未来展望，包括实现标准化、降低检测成本、形成整合的检测平台以适应现场即时检测（POCT）的需求，以及靶标多重检测等。这些技术突破将有助于使CRISPR/Cas检测技术成为更加理想的分子诊断工具。
图1. 基于CRISPR/Cas的靶标免扩增检测示意图 目前建立的基于CRISPR/Cas的检测策略主要利用了三类Cas效应蛋白（II型、V型和VI型），见表1。
表1. 基于不同Cas蛋白的CRISPR/Cas检测系统的不同特征
由于Cas12或Cas13酶具有高效的“反式剪切活性”（又名“附属剪切活性”），它们在guide RNA引导下特异性识别/剪切靶标核酸后，还会被激活针对ssDNA或ssRNA的反式剪切活性，剪切ssDNA或ssRNA报告探针，产生荧光信号。在没有预扩增的情况下，CRISPR/Cas系统的检测限通常位于皮摩尔到飞摩尔水平，远低于理想的要求。以下列出了提高检测灵敏度所需要解决的主要挑战（图2）。首先，Cas酶的反式切割活性可能因guide RNA的长度和序列而有很大差异。因此，应通过比较不同候选guide RNA的检测效率来优化CRSIPR检测体系。其次，在CRISPR/Cas检测系统中被切割的报告探针的荧光信号可能受限于荧光信号检测仪器的灵敏度。例如，引入数字微滴PCR（ddPCR）的概念，将反应体积减小到nL水平，从而实现超灵敏甚至单分子检测。此外，CRISPR/Cas系统能够灵活匹配不同的信号输出模式。常用的基于FQ标记探针的荧光读取分析模式虽然简单方便，但输出信号相对较弱，因此，尝试其它信号输出模式，例如如电化学、表面增强拉曼光谱、纳米孔传感平台等，可能有助于CRISPR/Cas检测系统提升灵敏度。
图2. 免扩增CRISPR/Cas检测的挑战
1.CRISPR/Cas系统的guide RNA和信号报告器的优化在CRISPR/Cas检测系统中，guide RNA和信号报告器是两个关键组成部分。前者对于检测至关重要，因为只有具备特定的靶向识别才能激发后续的反式剪切，因此guide RNA的效率很关键，也可以通过多条guide RNA提升检测效率。信号报告器是直接决定信号读出性能的关键要素。因此，提高免扩增CRISPR/Cas检测灵敏度的初始策略是优化guide RNA，例如长度和碱基排列，以及报告器类型（ssDNA或ssRNA），如图3。
图3. CRISPR/Cas系统的crRNA和信号报告器的优化
2.数字CRISPR超灵敏检测平台 与常规检测相比，数字检测中形成的反应单元是纳升级别的液滴，体积非常小。CRISPR/Cas系统与液滴数字技术相结合，可以建立用于免扩增直检的超灵敏生物传感平台（图4）。基于CRISPR/Cas的免扩增数字RNA检测（SATORI）平台是在CRISPR/Cas13和微室阵列技术的基础上设计的，可在5分钟内检测低至5
fM浓度的靶标，这大大优于其他免扩增的CRISPR/Cas13检测平台（∼50
pM或3
×1010拷贝/mL。
图4. 数字CRISPR超灵敏检测平台示意图
3.更灵敏的信号传感器 除了检测由报告探针切割产生的荧光信号之外，研究人员还设计了多种信号输出模式，例如电流变化和拉曼散射强度（SERS）的变化（图5）。电化学传感器利用CRISPR/Cas系统反式切割效应剪切固定在电极表面的ssDNA/ssRNA报告探针，导至后续电流变化。同样，表面增强拉曼散射作为的CRISPR/Cas系统的生物传感器依赖于单链探针与SERS活性阵列的分离引起的拉曼强度变化，与没有反式切割的SERS信号相比，信号显著降低。上述生物传感设备材料成本可控，样品投入到结果产出的时间很短，通常在60分钟内，因此，它们非常适用于即时检测
（POCT）。在灵敏度方面，CRISPR/Cas系统结合上述生物传感器大多处于fM-pM水平，比基于数字CRISPR检测平台的灵敏度低约3个数量级。但是，通过利用纳米材料和后扩增，上述生物传感器的检测灵敏度有望达到aM级的LoD。
图5. 信号换能器的形成
4.CRISPR级联信号放大系统 目前，CRISPR/Cas介导的免扩增核酸检测LoD通常为pM水平，无法满足大多数诊断病例的要求。除上述情况外，一系列采用级联信号放大的方法研究已经显示出提高基于CRISPR/Cas的检测方法灵敏度的巨大应用前景。通常，主要集中在基于Cas酶的级联信号放大系统和基于核酸回路的级联信号放大系统上（图6）。前者包含串联蛋白酶反应的系统，利用第一个核酸酶活性的产物作为下一个酶促反应的底物来放大信号。由于两种酶的高催化活性，最终检测信号可以提高2-3个数量级。在基于核酸回路的级联放大系统中，通常设计具有一定特殊结构的探针作为中间体。Cas酶被靶标分子激活后，非特异性切割中间体，导至中间体转化，从而带来后续的核酸循环回路，如CONAN系统，就利用Cas酶反式剪切中间体释放第二种crRNA实现指数级信号放大。
由于Cas核酸酶的反应条件简单，检测时间短，免扩增CRISPR/Cas检测技术显示出与便携式设备的出色兼容性，可与微流控芯片和便携式信号收集器（如智能手机）连接作为信号分析仪，或利用侧向流层析（LFA）检测技术，免扩增CRISPR/Cas检测系统可以轻松用于开发通用POCT或家庭自测平台。迄今为止，免扩增CRISPR/Cas的检测方法已在5分钟内实现了从样品投入到结果产出的过程。这比黄金标准（通常为4-6小时）短得多。随着免扩增CRISPR/Cas的检测技术在临床诊断、精准医疗和环境监测等不同领域的创新应用越来越多，我们有理由认为，这项发展中的技术将在短期内产生更多突破。
参考文献： Li
H, Xie Y, Chen F, Bai H, Xiu L, Zhou X, Guo X, Hu Q, Yin K.
Amplification-free CRISPR/Cas detection technology: challenges,
strategies, and perspectives. Chem Soc Rev. 2023 Jan 3;52(1):361-382.
doi: 10.1039/d2cs00594h. PMID: 36533412.
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