立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索
小桔灯网 门户 资讯中心 技术杂谈 查看内容

寡核苷酸合成的底层技术 – 亚磷酰胺三酯合成法

2023-5-19 09:22| 编辑: 归去来兮| 查看: 1411| 评论: 0|来源: LGC基因组学

摘要: 那么,如果实现这一连串的步骤呢?




寡核苷酸合成的底层技术

亚磷酰胺三酯合成法



寡核苷酸合成是许多分子生物学应用的基础,包括聚合酶链反应(PCR)、基因编辑、DNA测序和治疗/药物输送。在过去35年里,我们在诊断检测、生物技术和药理学方面所看到的科学进步,部分是由寡核苷酸合成方面的进展所支持的。


现今大多数商业化DNA合成仪所使用的底层技术是亚磷酰胺三酯合成法(如图一),一般称为柱式合成。此方法具有高效、快速偶联等优点,在DNA化学合成中广泛使用。


DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸,而是由3’端开始。先将酸活化的脱氧核苷亚磷酰胺分子耦合到一个固定在固相(一般是硅材质表面)的脱氧核苷酸分子上。在第一个合成循环中,核苷酸链从第一个固定在表面上受保护的核苷酸分子开始延伸。其中,经常采用的固定化表面主要是可控孔度玻璃( CPG)或者聚苯乙烯微珠(PS beads)。试剂被泵入并流经材质表面,诱导分步添加的核苷酸单体加入到寡核苷酸链上,使寡核苷酸链不断延长。

图1. 磷酰胺三酯法合成循环示意图


具体反应步骤如下:

Steps:

1

脱保护基团 (Deblocking)

用三氯乙酸(TCA)脱去连接在固相载体CPG上的核苷酸保护基团DMT(二甲氧基三苯基),获得游离的5’-羟基端,以供下一步缩合反应。

2

活化(Activation)

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱,形成亚磷酰胺四唑活性中间体,此中间体将于CPG上已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3

偶联(Coupling)

亚磷酰胺四唑活性中间体与CPG上核苷酸的游离5’-羟基发生亲和反应,缩合并脱去四唑,此时合成的寡核苷酸链延长一个碱基。

4

加帽(Capping)

缩合反应后为了防止CPG上未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸,常用乙酰化试剂(如乙酸酐和N-甲基咪唑混合物)来封闭此端羟基。

5

氧化(Oxidation)

缩合反应式核苷酸单体是通过亚磷酯键与CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。


那么,如果实现这一连串的步骤呢?


DNA 合成仪就是将上述一系列化学合成过程进行自动化,精准可控的设备。仪器主要由试剂驱动系统、试剂瓶组、碱基瓶组、压力管路及输送管路、亚磷酰胺瓶、压力排气管、输送电磁阀、辅助真空、合成柱、路节流阀、废液瓶、排气装置、电导池、电池、控制器等多个部分组成。LGC Biosearch Technologies™的核酸化学产品线 (NAC – Nucleic Acid Chemistry) 旗下 MerMade™ 核酸合成仪系列,可以满足不同合成规模,通量和种类的需求,其中MerMade 6/12 合成仪是广受认可的型号,为合成必备。

MerMade™ 12合成仪

MerMade™ 6/12 寡核苷酸合成仪,专为使用标准或改良的化学方法以合成柱的形式合成 DNA,RNA 和 LNA 寡核苷酸而设计,非常适合需要中等通量且最大灵活性的实验室。该仪器已在许多大学、以及 cGMP 环境下运行的制药和诊断公司中使用。该机器有 6 个或 12 个合成柱位配置,可提供多达 24 个酰胺位置。它能够在同一轮中将标准寡核苷酸,简并寡核苷酸和修饰寡核苷酸组合在一起生产,规模从 50nmol 到 200µmol(在某些CPG载体下可超过 400µmol)不等。

注射头

合成柱位细节

让我们来仔细看看,它的标配特性和可选特性:

1

标配特性:

10至24个亚磷酰胺单体端口;

2

每列的规模范围从20nmol到超过200µmol;

3

软件灵活易用,可在Windows 7上运行;

4

提供运行记录;

5

混合主链能力(硫代磷酸酯和磷酸二酯);

6

Dell PC 和显示器附带延长保修;

7

预装了标准合成方案;

8

包含切割装置。

9

10至24个亚磷酰胺单体端口;


1

可选特性:

低死体积瓶架,用于昂贵的改良剂;

2

6至12个合成柱;

3

多达24个亚磷酰胺单体端口

(如需更多端口,可向我们询问);

4

三苯甲基监测;

5

UPS备份以在断电时允许合成恢复;

6

多个试剂盖适配器;

7

条码读取器;

8

自定义软件与内部LIMS的集成。


MerMade™ 6/12 能够在保证通量的同时,给您的实验提供最大程度的灵活性,不仅为您的实验带来便捷,更节省了您的时间。


此外,我们还提供4柱、48柱、192柱合成仪,以及一站式核酸合成试剂耗材,满足不同合成规模,通量和种类需求,详细见下表:

以上的“秘籍”,你get了没~


如果想要进一步了解,这里偷偷放个彩蛋~

一个彩蛋!

今年5月28-30日即将在英雄城南昌举办的第20届CACLP博览会LGC基因组学也会倾情参与,期待您莅临A6-0505展位,共探分子诊断的前沿技术发展,还有内容囊括小RNA建库、核酸合成、核酸分子检测方法开发、及核酸提取卫星会等您到来!


以下是日程,建议保存哦:

请大声喊出析析的展位号:A6-0505 !!!



公 司 介 绍

LGC, Biosearch Technologies



LGC Biosearch Technologies提供完整的基因组学产品组合,包括基因组分析工具、仪器和服务,以支持全球客户的关键应用。我们还能提供PCR、核酸提取和NGS相关试剂耗材,为您的实验过程排难解忧。

艾吉析科技(上海)有限公司

地址:上海市静安区北京西路968号

嘉地中心9楼901-903室

官网:www.biosearchtech.com

邮箱:genomics.china@lgcgroup.com

免费热线电话:400 921 6156

扫码关注析析

声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部