基于膜阻阀的离心微流控全自动核酸分析系统

本文展示一种基于膜阻阀和LAMP扩增技术实现的离心微流控全自动核酸分析系统。

一、高致病性禽流感病毒提取检测

所谓的膜阻阀，就是通过利用亲疏水性质不同的超细孔径穿孔的聚碳酸酯薄膜叠加组成的，因此能够在不同压力的作用下突破。试验仪器原理构造如图 1所示，其包括电机系统，温度控制系统（采用非接触式热空气加热方式，包含一种导热底板，其表面覆盖有导热盖，形成封闭的加热腔，几个集成在底板和盖子的加热元件，以及两个用于反馈腔温的PT100传感器），光学检测系统（包含荧光检测模块，使用发光二极管作为光源，488nm的过滤器，透镜，二色分束器，两个反射器和一个光检器装载在55×45×10 mm的盒子内），以及一个控制系统（用于加热元件温度控制，旋转轴转速控制，光源强度调节，数据采集，电源管理，与用户电脑的无线通讯）。

图 1.仪器构造图

所用芯片的直径为100mm，由上至下包含三层结构（如图 2所示）：0.1 mm的PET 自粘性胶带，2mm的PMMA顶板（仅包含主体腔室结构，不包括管路和扩增结构），膜阻阀层，2mm的PMMA底板（主要包括所有扩增结构和管路，裂解腔和输送腔，以及膜阻阀出口结构）。芯片包含五个液体储存腔（除储存乙醇的腔室外，均用于长期储存液体试剂），以及位于顶部中间位置的样本腔。芯片所用裂解液（85uL），清洗液1（32.8uL，无乙醇），清洗液2（23uL，无乙醇），洗脱液（30uL）均源自德国凯杰公司的标准试剂盒。实验前，在乙醇腔，清洗液1腔，清洗液2腔加入适量乙醇完成试剂配制即可。

图 2. 芯片层间结构

膜阻阀层采用12层5mm直径的聚碳酸酯膜构成阻力层（位于腔室和流出管路的交叉点位置），12层2mm直径的0.22um孔径的疏水聚碳酸酯膜作为稳压层（位于气路和储液腔室的交界处）。聚碳酸酯膜采用表面疏水处理（Scotchguard, 3M, USA）制作疏水膜，与其未改性的膜叠加组成膜阻阀，孔径为12~0.4μm。膜夹在两层双面胶（3M 9454-300LS, 3 M,USA）之间，为了防止膜被双面胶堵塞，因此在两张双面胶上开有3mm的孔作为出口。当液体接触膜阻阀时，润湿膜上的微孔产生反压，防止液体通过小孔，使阀门的初始状态关闭，当离心压力超过破裂压力时，则可以开启膜阻阀（具体压力值的计算参考文献）。芯片内部的4个虹吸阀采用亲水试剂Vistex 111-50（FSI Coating Technologies, USA）处理，虹吸阀的宽度0.4mm，深度为0.1mm（有效防止之前储液腔内的残余试剂在后续实验步骤的高速条件时漏出进入提取管道，影响提取效果）。芯片的RNA提取膜事先磨碎，用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水重悬，然后加入至芯片的提取通道内（尾部有100um深度的堰结构防止提取膜流出），通过离心的方式干燥。废液腔内填充吸水性纤维，以防止废液回流。分发腔和PCR扩增腔连接的毛细阀宽度为0.15mm，深度为0.075mm。

6个PCR扩增腔室分别放置H1N1，H3N2，H7N3，H7N9，H9N2扩增试剂，用于检测流感病毒的五种亚型，具体的检测原理见文献相关内容。

二、检测逻辑

1. 如图 3A所示，在实验开始前，将85uL的无水乙醇加入至乙醇腔中，另外加入43.2uL乙醇至清洗液1腔，以及53uL乙醇至清洗液2腔中，最后在样本腔加入40uL左右的样本，对芯片的所有加样口进行密封；

图 3. 芯片检测流程

2. 如图 3B所示，首先逆时针500rpm转动，持续20s，使裂解液和样本突破膜阻阀进入裂解腔，随后维持转速状态10min，使样本充分裂解，释放RNA；

3. 随后，增加转速至1000rpm，使乙醇突破膜阻阀进入裂解腔，混合1min用于沉淀RNA；

4.  如图 3C所示，停止芯片，使裂解腔中的混合液进入虹吸阀顶部，然后增加转速至2000rpm，使包含RNA的裂解混合液突破虹吸阀，进入提取管道，RNA与管道中的膜纤维吸附，废液进入左侧的废液腔，同时清洗液1突破膜阻阀进入输送腔中；

5. 使用相同方法使清洗液1突破虹吸阀，清洗提取管道中残留的盐离子和蛋白质；

6.  如图 3D&E所示，增加转速至2750rpm，使清洗液2突破膜阻阀，随后使用相同方法突破虹吸阀，并增加转速至4750rpm，持续3min，使清洗管道中的乙醇完全流尽，同时洗脱液突破膜阻阀进入另一输送腔中；

7. 随后将低转速使洗脱液通过虹吸阀顶部，然后顺时针增加转速至500rpm，持续3min，使洗脱液充分浸润提取管道，同时升温至42℃，使PCR扩增腔内的扩增试剂胶状物熔化，释放试剂；

8.  如图 3F所示，增加转速至5000rpm，使洗脱RNA的洗脱液进入收集腔中；

9.  如图 3G所示，停止芯片然后增加转速至1200rpm，使洗脱液通过虹吸阀进入右侧的分发腔，多余的废液进入分发腔末端的废液腔中；

10. 如图 3H所示，增加芯片转速至5000rpm，使6个分发腔内的液体进入PCR扩增腔，和扩增腔内的扩增试剂混合，扩增体积为12.5uL；

11. 升温至63℃，开始RT-LAMP扩增；

参考文献：[1] Liu Q, Zhang X, Chen L, et al. A sample-to-answer labdisc platform
integrated novel membrane-resistance valves for detection of highly pathogenic
avian influenza viruses[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2018, 270:
371-381.

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（编者注：深圳市呈晖医疗科技有限公司是深圳市刚竹医疗科技有限公司全资子公司。呈晖医疗团队一直以来专注于研发基于微流控的全自动核酸检测系统，以解决当前核酸检测的痛点。注册此公众号主要分享团队对于微流控技术以及IVD行业的认识，欢迎关注。）