《Nature review》综述：细胞因子疗法

可以采用两种策略来开发蛋白质突变体；定向进化和蛋白质理性设计。在定向进化中，随机突变被引入感兴趣的基因中，随后使用多种选择方法，例如酵母和噬菌体展示，以获得具有所需功能的蛋白质。与理性设计相反，定向进化不依赖详细的结构知识和蛋白质3D结构预测，因为它基于突变体的功能选择。因此，定向进化是工程蛋白的一种流行且成功的策略。

已开发出合理重新设计细胞因子的方法，而不是使用定向进化。这些技术在很大程度上依赖于细胞因子结构的详细知识和先进的蛋白质模型。例如，IL-22的晶体结构与其受体复合物IL-22Rα/IL-10Rβ结合，使得通过突变四个关键氨基酸残基降低对IL-10Rβ的亲和力成为可能。这种IL-22突变体具有更高的受体和细胞特异性，从而减少了不良的促炎症反应，并保持了其体内再生功能。为了减少多效性，类似的方法设计了治疗有效的细胞因子变体，如IL-10、IFNγ、IL-12和IL-4。

细胞因子的循环半衰期决定了细胞因子疗法的体内效应。用聚乙二醇（PEG）使蛋白质功能化是延长其在循环中持久性的一种有效方法。聚乙二醇化增加了蛋白质的分子量，扩大了流体动力学直径，从而减少了肾脏清除率，并减少了与血浆成分的相互作用，从而降低了免疫原性。聚乙二醇化已成功应用于集落刺激因子和干扰素。

Synthorx设计了一种新的PEG-IL-2变体（THOR-707），THOR-707的PEG部分特异性阻断与IL-2Rα亚基的结合位点，但保持与其他受体亚基的相互作用（图b），改善了效应T细胞和NK细胞的扩增和激活，并在癌症模型中显示出更好的药代动力学和安全性特征。聚乙二醇化细胞因子的一个可能的限制是患者可能产生抗PEG抗体，该抗体可使细胞因子失活或引发炎性免疫反应。

借助于计算和数据驱动方法以及硬件和算法能力的最新进展，蛋白质可以从头设计。计算工具有望帮助克服细胞因子药物的关键限制，包括多效性、冗余性、不良药代动力学和毒性。可以采用从头蛋白质设计来创建合成细胞因子（合成蛋白），例如IL-2Rβ/IL-10Rβ、IL-2Rβ/IL-4Rα或IL-4Rβ/IFNαR2，从而激活不同的信号通路。从头设计方法还提供了一种有效分离细胞因子多效性和靶向特异性途径的策略。从头设计的蛋白质本质上是外来的，因此可能存在免疫原性问题，这是新细胞因子临床转化的重要考虑因素。

在基因层面上融合一种细胞因子与其他蛋白质可以帮助重塑细胞因子的生物分布特征。该方法可用于将细胞因子靶向特定位点或细胞类型。细胞因子融合物有助于促进肿瘤定位，克服细胞因子药物不良的药代动力学财产和不利的生物分布特征。

免疫细胞因子：过去15年 多年来，已设计出具有IL-2的多抗体-细胞因子融合构建物，称为免疫细胞因子，并正在进行治疗各种类型癌症的临床试验。将IL-12基因融合到肿瘤靶向抗体可以增加这种细胞因子的治疗窗口并限制毒性，如将IL-12融合到L19抗体（抗Fibronectin,在许多癌症中过量表达在血管上）。大多数免疫细胞因子的目的是向肿瘤输送促炎细胞因子，但也可以将抗炎细胞因子导向炎症组织。IL-22免疫细胞因子靶向肠道黏膜以治疗溃疡性结肠炎。

免疫细胞因子与非靶细胞的相互作用会引起副作用。为了提高受体和细胞特异性，新的工程疗法将免疫细胞因子方法与重组细胞因子突变体相结合。比如Orionis Biosciences正在开发一种AcTakines，它结合了靶向抗体和受体亲和力降低的细胞因子突变体。AcTakines的亲和力降低会阻碍细胞因子活性，直到融合蛋白在靶细胞上的细胞因子受体附近聚集，从而降低脱靶效应。

肿瘤定位：胶原蛋白是TME（肿瘤微环境）的主要成分，因此是细胞因子肿瘤定位的有趣靶点。有研究团队将胶原结合蛋白与IL-2或IL-12融合，在肿瘤内给药时将这些细胞因子锚定在TME中的胶原上（下图a）。

前药策略：克服脱靶效应的一种方法是设计前药结构，通过与细胞因子连接的肽或蛋白质使其失去活性。例如，失活单元可以被疾病部位过表达的蛋白酶切割，以重新激活细胞因子。这一策略在癌症治疗中特别有用，已经确定了几种肿瘤特异性蛋白酶。细胞因子前药设计通常与重组细胞因子结合。Arrow Immune和Werewolf Therapeutics正在使用这种肿瘤蛋白酶方法开发各种细胞因子的前药，包括IL-2、IL-12和IFNα2b。

纳米医学方法有可能通过将细胞因子递送到特定器官或（免疫）细胞来调节细胞因子的生物利用度和生物分布。然而，由于大多数细胞因子通过与细胞表面受体的相互作用而起作用，纳米药物策略通常应避免免疫细胞的摄取，以促进细胞表面的相互作用。第一种方法是用IL-2和抗CD137对聚乙二醇化脂质体进行表面功能化，以将IL-2递送至效应T细胞（下图b）。静脉注射后，脂质体优先积聚在肿瘤中，诱导CD8+T细胞，并在小鼠中诱导抗肿瘤反应。一种非细胞靶向方法涉及靶向IV型胶原的聚合物纳米颗粒，其将抗炎IL-10递送至动脉粥样硬化斑块（下图b）。在这些颗粒与胶原结合后，聚合物降解缓慢释放IL-10，从而允许其随后与炎性细胞相互作用。

基于纳米颗粒递送mRNA后调节细胞因子表达的治疗策略具有潜力。然而，mRNA会被核酸内切酶快速降解，并被Toll样受体（如TLR7和TLR8）识别，导至固有免疫激活，促炎细胞因子（如TNF和IL-6）分泌。mRNA的化学修饰能够在降低固有免疫激活的情况下实现有效的蛋白质翻译。此外，mRNA必须通过细胞膜稳定地输送到细胞质中。实现这一点的努力导至了用于mRNA递送的脂质纳米颗粒（LNP）技术。

为了改善IL-12的肿瘤滞留，设计了一种LNP-mRNA，其编码与lumican（一种胶原结合蛋白）融合的IL-12。LNP配方中的脂质可激发免疫反应且改善融合蛋白的翻译。肿瘤内注射后，表达的IL-12融合蛋白介导抗肿瘤作用和全身免疫记忆激活，导至小鼠黑色素瘤模型中的远端肿瘤消退。此外，编码细胞因子混合物的肿瘤内注射mRNA疗法可以重塑TME，增强T细胞对癌症细胞的反应，提高了应答率。

尽管纳米颗粒在局部给药，但它仍会泄漏到循环系统，到达肝脏并引起脱靶效应。可以将miR-122结合位点引入mRNA序列中。miR-122结合后，互补mRNA链被切割，蛋白质表达停止。该策略利用了肝脏中miR-122的丰富性，阻止了该器官中mRNA的翻译。一些公司目前正在进行I期临床试验，以探索这些新的mRNA编码细胞因子的免疫肿瘤治疗的安全性。尽管局部递送策略很有前景，但这种方法在治疗深层肿瘤方面面临挑战，这需要系统的mRNA治疗策略。

全身mRNA治疗的一种策略是利用肝脏中的高LNP积累来表达细胞因子，这种方法提高了细胞因子的血液半衰期，并通过较低和较不频繁的剂量降低其毒性。编码IL-2-人白蛋白融合蛋白的治疗性mRNA在肝脏中的翻译刺激T细胞根除肿瘤。该药物目前正在进行治疗实体瘤的I/IIa期临床试验（NCT04455620）。

用mRNA靶向肝脏以外的其他部位是复杂的，利用增强的渗透性和滞留效应的被动肿瘤靶向方法可用于表达可重塑TME的细胞因子。例如，编码IL-15的LNP-mRNA可以治疗肺转移瘤。但mRNA疗法的临床转化仍面临挑战，例如引发的免疫原性。当mRNA序列改变时，LNP-mRNA的生物分布概况保持相似，改变LNP的组成改变了生物分布分布，并有助于倾斜到特定器官。

CAR T细胞通过基因工程识别肿瘤抗原，从而特异性消除癌症细胞。使用自体细胞减少了免疫介导的宿主排斥的机会，但增加了制造过程的复杂性，并大大增加了成本。尽管CAR T细胞疗法在血液学恶性肿瘤中取得了临床成功，但它仅对一小部分患者有效。结合细胞工程和细胞因子疗法将有助于克服细胞和细胞因子治疗目前面临的困难（下图b）。

阻碍CAR T细胞治疗有效性的一个问题是工程T细胞无法克服免疫抑制性TME。通过工程化表达IL-12的CAR T细胞可有效地耗尽肿瘤相关的巨噬细胞，治疗效果已在临床试验中得到证实，但引起剂量限制性毒性。此外，CAR T细胞治疗通常受到TME中低细胞扩增和存活率以及CART细胞积累不良的限制。为了避免施用细胞因子的需要，CAR T细胞可以表达CCL19以及IL-2和IL-7。

重组细胞因子也可以整合到细胞工程中。例如，可以创建一个IL-2变体，选择性地靶向表达hIL-2Rβ的T细胞，而不干扰天然T细胞和天然IL-2信号。蛋白质工程也可用于克服在施用工程化T细胞之前出现的挑战。例如，一种新的IL-2变体可以刺激体外T细胞扩增，并将其维持在类干细胞的状态。这有效地防止了T细胞的末端分化，从而提高了治疗效率。

细胞工程也可用于细胞因子递送。例如，表达GM-CSF的T细胞可以将细胞因子靶向中枢神经系统恶性肿瘤，这可能为细胞因子通过血脑屏障输送提供了新的机会。作为另一个例子，合成的Notch受体可以被引入工程T细胞。synNotch受体识别特定的癌症相关抗原，T细胞显示特定的蛋白表达。该方法可用于肿瘤中治疗性细胞因子的局部选择性表达，如IL-2和TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL）。

重要的是，细胞工程不限于T细胞；例如，表达特定细胞因子的树突状细胞可被设计为激活T细胞，或NK细胞以消除肿瘤。NK细胞本身也可以以更直接的方式进行基因修饰；例如抗CD19 CAR NK细胞作为CD19阳性癌症的治疗。这些CAR NK细胞被修饰以额外表达IL-15，在IL-15 CAR NK细胞治疗的I期和II期临床试验（NCT03056339）中，大多数患者显示出对治疗的反应，这表明CAR治疗可以用T细胞以外的免疫细胞类型开发。

本综述中描述的生物工程进展为未来几年基于细胞因子的治疗的数量和疗效的重大进展提供了发展框架。细胞因子疗法的进展有望从两个方向出现；首先，技术创新，重新设计细胞因子并将其运送到病理进展的部位；第二，改进的试验设计、复杂的患者分层和基于精确医学的方法。这两个方向都需要在各种疾病中利用基于细胞因子的新疗法。随着这些研究方向的进展，科学家必须记住，偏离内源性分子的蛋白质工程存在免疫原性风险。

预计将出现更多的方法来改善细胞因子的活性、寿命、药代动力学和用于治疗目的的递送。目前的工作主要集中在开发细胞因子受体激动剂；然而，生物工程也可以寻求抑制细胞因子受体激活的疗法，可抑制多种疾病中的炎症反应。能够在基因水平上控制细胞因子表达的技术可能会作为更有效的细胞因子治疗变体出现。此外，新兴技术，包括单细胞分析技术或人工智能（AI）引导的设计，应继续改进基于细胞因子的治疗。这些发展将导至细胞因子受体激动剂的更快速和更有效的设计。最后，对纳米颗粒结构-功能关系的了解将导至基于纳米药物的药物的开发，这些药物具有更好的生物分布特征和靶向能力。

基于最近基于细胞因子的技术的成功实验研究，预计将进行更多的细胞因子治疗的临床试验。预计新疗法的成功不仅来自于改进的配方，还来自于进行临床试验的创新方法。此外，基于细胞因子的治疗可能会与现有疗法相结合，例如检查点抑制剂或CAR T细胞。