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深度综述:CRISPR/Cas用于肿瘤治疗药物的体内递送

2023-3-23 16:02| 编辑: 归去来兮| 查看: 1273| 评论: 0|来源: 小桔灯网 | 作者:动力彩虹

摘要: 如今,基因编辑的主要工具是CRISPR/Cas9系统


基于基因编辑的治疗策略赋予了超越细胞机制和改变导至疾病发展(如癌症)的缺陷基因的能力。如今,基因编辑的主要工具是CRISPR/Cas9系统。为了临床应用这种基因编辑系统,一个重要的障碍仍然存在,那就是将CRISPR/Cas递送到体内和体外的各种靶细胞。


近日,一组来自伊朗的研究团队在杂志Cancer Gene Therapy上发表了一篇题为“Viral vectors and extracellular vesicles: innate delivery systems utilized in CRISPR/Cas-mediated cancer therapy”的综述文章。CRISPR-Cas系统可以使用各种策略(如病毒载体、细胞外囊泡(EV)、物理方法和纳米复合物)输送到哺乳动物细胞中;在文章中,研究团队回顾了关于病毒载体、细胞外囊泡(EV)这两种已被证明与人类细胞相容的天然基因递送系统的最新研究。并讨论了病毒载体和细胞外囊泡(EV)在递送CRISPR/Cas系统用于癌症治疗方面的优势和局限性。


图片来源:Cancer Gene Therapy


一、CRISPR-Cas9递送中使用的病毒载体

CRISPR-Cas9系统可用于精确定位癌症特异性序列的变化。基于CRISPR/Cas的方法为利用基因治疗和免疫治疗治疗癌症提供了一条巧妙的途径。


病毒是基因传递的真正载体。哺乳动物基因治疗已通过重组和假型病毒载体实现。CRISPR/Cas递送最常用的病毒载体是腺相关病毒(AAV)、腺病毒载体(AdVs)和慢病毒载体(LV),它们正在临床试验中使用。


装载CRISPR/Cas系统的病毒载体。

图片来源:Cancer Gene Therapy


腺相关病毒(AAV)

AAV是一种小型、无包被的单链DNA病毒,对人类没有致病性,具有相对较低的免疫原性、细胞毒性和染色体整合概率(如下图)。此外,不同类型的AAV可用于基因递送到多种细胞中,如肺、心脏、神经元和肌肉细胞,从而使其成为组织特异性应用的极好的载体。迄今为止,许多基于AAV的基因疗法已获得FDA批准,例如,在庞贝病和遗传性视网膜疾病(IRD)中,表明了AAV载体的有效性。此外,AAV对CRISPR/Cas9系统的有效递送为疾病建模铺平了道路,如神经退行性异常、肌营养不良、肝病和镰状细胞病。


尽管如此,但AAV有限的包装能力和基因组长度限制了其承载不超过5 kb,携带SpCas9蛋白等大型货物仍然是一个相当大的限制。科学家们设计了许多方法来绕过AAV包装能力有限的障碍。一种策略是使用两种不同标记的AAV共同转导细胞,一种携带sgRNA,另一种携带Cas9蛋白。然而,这种方法需要高病毒剂量和确认共转导。为了将更长的基因输送到宿主细胞中,科学家设计了一种三重AAV系统。另外,AAV也已被证明是递送新型CRISPR DNA碱基编辑工具的潜在系统。


AAV的特点,包括低免疫原性和细胞毒性,以及染色体整合的可能性很小,使其成为CRISPR/Cas系统的理想输送系统。除此之外,具有多种类型和多样的递送方法,如双AAV载体和三AAV载体,弥补了其与其他病毒载体相比的局限性,并使其成为基因递送的前沿。


用于基因递送的腺相关病毒(AAV)。

图片来源:Cancer Gene Therapy


腺病毒载体(AdV)

AdV是一种双链DNA病毒,可以转导广泛的分裂细胞和非分裂细胞。这些载体可以携带长达37kb的基因 ,并且在转导之后,它们产生游离DNA(episomal DNA),而不是整合到基因组中,消除了CRISPR/Cas基因编辑的脱靶效应。


第三代AdV载体允许克隆高达35kb的病毒基因;因此,它们突破了递送CRISPR/Cas9系统的尺寸限制屏障,且这一代不会引发慢性免疫反应。重组AdV5已显示出在小鼠体内CRISPR/Cas9介导的人α-1-抗胰蛋白酶基因敲入的潜力,并且已证明基因表达持续超过200天。在最近的一项研究中,AdV向人类肝细胞递送CRISPR/Cas12a也表明其在人类细胞基因编辑方面的潜力。此外,AdV结构蛋白是非常可操纵的,这有利于产生具有组织特异性的AdV。


总之,最新的AdV具有巨大的包装能力,且不会引发慢性免疫反应,消除了CRISPR/Cas基因编辑的脱靶效应,加上AdV的安全性,可以大规模生产,并且生产成本效益高,这使得它们对于CRISPR/Cas的递送必不可少。AdV成为2019年冠状病毒病(新冠肺炎)mRNA疫苗的首选疫苗,这一事实验证了这些有益特征。


用于基因递送的腺病毒载体(AdV)。

图片来源:Cancer Gene Therapy


慢病毒载体(LVs)

HIV-1衍生的LV是单链RNA(ssRNA)病毒,主要用于将所需转基因整合到分裂和非分裂细胞中(如下图)。他们的基因运送能力约为9 kb,被富含脂质的衣壳包围。LV的第三代和第四代对临床应用最为安全。


最近的一项研究使用LVs递送的CRISPR/Cas9系统敲除了小鼠体内的HIF-1α,在注射后三天,它显著降低了肿瘤组织中HIF-1α的表达,显示出有价值的抗肿瘤作用。产生融合癌基因的染色体易位在某些癌症中很常见,并且是重要的肿瘤发生因素。有研究团队使用基于LVs的CRISPR/Cas9系统诱导BCR-ABL融合基因内含子的缺失,这导至BCR反式激活域的显著缺失以及ABL DNA结合域的移码突变。不仅如此,LVs递送的CRISPR/Cas9系统的能力正在扩展到HIV-1和HBV感染的靶向治疗以及遗传缺陷疾病的治疗领域,如囊性纤维化和神经变性疾病。由于LVs会将转基因整合到宿主基因组中,并且由于其长期的基因表达,脱靶效应可能会引起关注。为了解决这一风险,开发了整合缺陷慢病毒载体(IDLV),以提供短暂的CRISPR/Cas表达。


用于基因递送的慢病毒载体(LVs)。

图片来源:Cancer Gene Therapy


二、CRISPR-Cas9递送中使用的

细胞外囊泡(EVs)

细胞外囊泡是纳米级的非病毒递送系统,可用于各种目的,其中之一是用作靶向递送系统。EVs是由不同细胞产生的脂质包裹颗粒,其内源目的是细胞-细胞之前运输,如遗传物质和蛋白质。EVs可分为三大类:微囊泡(MV)、外泌体和凋亡小体。其中,具有30–150 nm直径的外泌体是选择性递送蛋白质和遗传成分的真正选择,包括CRISPR/Cas系统(如下图)。


外泌体在癌症诊断和治疗中的应用

外泌体因其在癌症诊断和治疗中的应用而备受关注。将所需货物装载到肿瘤衍生的外泌体中,可以促进细胞特异性方法进行癌症治疗。与单独应用药物相比,将Doxil装载入肿瘤衍生的外泌体,并将其注射到来源组织中,可以促进肿瘤抑制。外泌体在肿瘤细胞中CRISPR/Cas递送的潜力可以从其递送选择性和高效递送系统的能力推断出来。使用外泌体介导的基因递送,特别是在递送CRISPR/Cas系统的情况下,一个严重的问题是对外周和远处组织的潜在非靶向负面影响。


除了外泌体的包装能力外,将其设计成靶向递送载体也是一个基本目标。神经系统特异性的脑靶向外泌体显示出强大的治疗潜力,其他组织没有非特异性摄取。


外泌体的修饰和优化

与病毒不同,外泌体可以在大小上进行修饰。混合外泌体已被开发用于携带CRISPR/Cas系统等大型货物。混合外泌体不仅具有更大的包装能力,而且由于脂质体的正电荷,它们与带负电荷的RNA和DNA更有效地相互作用,使遗传物质更容易加载到外泌体中。


外泌体也可以用DNA适体(一种短的合成寡核苷酸)进行优化,以便将外泌体用作靶向递送系统。最近的一项研究使用外泌体表面的DNA适体,在体外和体内选择性地将CRISPR/Cas系统特异性地递送到肝癌细胞中。


有核细胞衍生EVs介导的水平基因转移的风险可以被视为EVs的一个限制,但RBC衍生EVs绕过了这一安全相关问题。可以推断靶向RBC-EV对特定癌症细胞传递CRISPR/Cas9系统的巨大潜力。


总之,EVs,尤其是肿瘤衍生EVs已被证明在CRISPR/Cas基础癌症治疗中绕过肿瘤防御机制非常有效。它们大小不同,含有不同的遗传物质,易于操作、可靠的基因传递和高安全性,使EVs成为强大的癌症治疗武器。


基于细胞外囊泡的基因递送系统。

图片来源:Cancer Gene Therapy


三、Vexosomes:外泌体包膜病毒载体

外泌体包裹的病毒载体(Vexosomes)是一种新的基因递送方法,它赋予病毒载体外泌体特征,如广泛的细胞嗜性、几乎无免疫原性和可大规模生产。EVs在其从细胞分泌时将病毒成分包封。


AAV/EV可以通过在其表面包含靶向肽以更选择性地递送基因。AAV/EV载体可以通过血脑屏障并有效地转导神经细胞。不同血清型的AAV,包括AAV1、AAV6和AAV9,已分别用于将转基因靶向递送至耳蜗和前庭毛细胞、神经元和少突胶质细胞。


将EVs和病毒载体的力量和潜力结合在一起,有望在基因递送领域,特别是CRISPR/Cas递送领域取得巨大的未来。


四、癌症诊断和治疗的临床转化

CRISPR/Cas技术提供了一种典型的基因编辑应用,但在临床癌症治疗中,它并不是主要的参与者。基于CRISPR的基因组编辑在不久的将来有望用于癌症诊断和治疗。


CRISPR-Cas9可用于精确定位癌症特异性序列的变化。例如,CRISPR/Cas9可以检测称为短串联重复序列(STR)的微卫星序列,该序列可以作为癌症标记。还开发了其他用于癌症相关突变的高精度酶核酸检测系统,称为DETECTR和SHERLOCK,分别使用Cas12a和Cas13。


除了癌症诊断之外,CRISPR还应用于临床癌症治疗。2016年,四川大学华西医院使用CRISPR/Cas9系统治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。在这项研究中,患者的T细胞经过基因改造,不表达T细胞活化抑制分子PD-1。因此,这种方法也被用于其他组织的癌症,包括膀胱、前列腺、肾脏和食道。此外,多重CRISPR-Cas9系统已用于同时敲除T细胞中的多个基因,包括T细胞受体(TCR)链和PD-1。所有这些努力都表明,CRISPR/Cas9系统是提高癌症免疫治疗水平的一大武器。


鉴于CRISPR/Cas系统可以引入人体细胞,它可能是保护我们免受致癌病毒侵害的有力工具。一些病毒能够在人类中引发癌症,例如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒(HBV和HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV),它们分别会导至肝细胞癌(HCC)、宫颈癌症和伯基特淋巴瘤。鉴于CRISPR/Cas系统可以引入人体细胞,它可能是保护我们免受致癌病毒侵害的有力工具。


五、结论与讨论

尽管CRISPR系统是最近才开发出来的,但它在癌症诊断和治疗方面已经取得了重大进展。研究人员可以使用CRISPR/Cas在体外、体内或体外抑制或诱导基因表达。尽管CRISPR面临一些挑战,但由于其在精确癌症治疗和免疫治疗方面的潜力,近年来受到了广泛关注。


尽管CRISPR在癌症诊断和治疗中的广泛应用,但仍存在局限性和需要在未来解决的问题。其中之一是CRISPR/Cas诱导的DSBs的概率,导至基因缺失。另一个问题是CRISPR/Cas系统的脱靶效应。


将CRISPR/Cas系统输送到体内或体外靶细胞有其自身的挑战。为了解决这些问题,使用了不同的递送系统,包括物理方法、病毒载体、细胞外囊泡、纳米复合物等。近年来,这两个真正的系统结合在一起,创造了一种新的载体,称为“vexosomes”。总的来说,递送系统的进步为高效的CRISPR/Cas癌症治疗带来了光明的前景。

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