Advanced Science : POCT感染核酸检测新平台

尽管实验室中的精密诊断仪器可以提供高度灵敏、选择性和可重复的检测，但它们通常只在大城市的医院提供，而在许多缺乏必要基础设施的发展中国家无法使用。POCT是实验室测试的简化版本，近年来作为一种测试趋势迅速发展。该技术旨在在患者的护理场所或附近进行诊断分析，消除了对复杂实验室样本处理的需要，并快速获得测试结果。因此，它们可以被送到各种初级卫生服务设施和低资源地区，以扩大人口覆盖范围。核酸检测能够以高灵敏度和特异性检测微生物的核酸，在诊断各种病原体中发挥着重要作用。常规聚合酶链式反应（PCR）需要复杂的温度控制，不适合现场测试。等温核酸扩增，如RPA和环介导等温扩增（LAMP），是POCT分子诊断的有力方法，因为它们只需要恒温加热器，如水浴或加热块，而不需要热循环仪。RPA反应接近常温（37–42°C），快速高效，通常只需20分钟即可产生肉眼可分辨的结果。它有可能在POCT开发中实现便携式、高灵敏度以及多路检测。

已经开发了用于资源有限环境的各种核酸检测。例如，Jonathan Cooper小组开发了一种基于纸张的POCT设备，用于在40分钟内通过逆转录酶LAMP（RT-LAMP）进行病原体检测。然而，诸如非整合核酸提取、开放检测系统增加交叉污染风险、对昂贵设备（即移液管、商用加热器、离心机、LED透照器等）和基础设施（即交流电源）的依赖性等问题严重限制了POCT的应用，尤其是现场测试。

近日，一组来自中国的研究团队在杂志Advanced Science上发表了一篇题为“Portable Paper-Based Nucleic Acid Enrichment for Field Testing”的文章。在文章中，研究团队描述了一种简单的便携式快速感染病原体的检测平台，包括SARS-CoV-2和幽门螺旋杆菌。在一个典型的on-site测试设置中，样品到结果的周转时间短于30分钟。结果可以用肉眼读取，也可以通过智能手机应用程序进行分析。该平台是灵活的，可以在一次测试中检测多种病原体。该平台为任何地方的传染源检测提供了一种快速、准确和方便的方法。

POCT平台的工作流中有四个主要步骤（如下图）。

（1） 样品收集和室温下裂解。

（2） 纸基核酸富集。将溶解的样品装入纸基富集芯片，并通过横向流动将核酸提取到结合盘（binding disc），然后用无水乙醇洗涤结合盘以快速除去残余水。

（3） RPA反应。将预安装管中的结合盘、引物、探针和RPA试剂加载到扩增芯片上，进行one-pot反应。芯片用粘土密封，并在40°C的电池供电便携式读取器中孵育20分钟。

（4） 结果读数。将芯片取出并放置在检测室中，并在488nm蓝光激发下观察。阳性对照显示亮绿色荧光，而阴性对照保持无色（或非常浅绿色荧光）。荧光结果可以直接从便携式读取器中可视化，并通过智能手机应用程序进一步分析。

研究团队设计了一种新型的基于纸张的核酸富集芯片，用于快速提取DNA/RNA。芯片上浓缩的核心是一个直径1.5 mm的纸装圆盘（图a）。将室温下使用裂解缓冲液裂解的100µL样品体积添加到样品装载区域，并通过毛细管作用穿过结合盘，核酸被捕获在结合盘上。干燥后的核酸结合盘，被直接用作RPA反应的扩增底物。在30分钟内，使用此纸基富集方法从核酸浓度低至100拷贝/毫升的样品中检测到荧光扩增信号。此纸基富集方法比普通FTA卡提取方法敏感100倍（图d）。一种可能的解释是，样品中更多的靶核酸被捕获在结合盘中，而扩增抑制剂通过侧向流被洗掉。

样品预处理的另一个关键问题是裂解。与纸基核酸富集相结合需要一种不加热的快速和室温裂解方法。研究团队在室温下测试了一些常见的裂解缓冲液（如Trizol、RIPA、NP-40和TritonX-100），以检测人造细菌或病毒样本。结果表明，Trizol和RIPA对人造病毒样品均表现良好，RIPA和NP-40对人造细菌样品均表现出色。

还通过实验验证了一个1.5毫米直径的结合盘足以进行核酸富集（图e，f）。此外还优化了用于富集的适当样品体积。结果显示，在1.5 mm结合盘上富集的100µL裂解样品的体积足以在8分钟的富集时间内获得满意的扩增（图g）。

研究团队设计并制造了一个可充电便携式读取器，用于恒温加热和终点荧光输出（图a，b）。便携式阅读器小巧轻便（15厘米×13厘米×7厘米，重量仅500克）。使用一对可充电锂电池，一次充电可使其运行8-9小时，并支持至少24批测试。实验室制造成本低于30美元，并且便携式读取器在每次使用后不需要更换或清洁。

恒温培养单元、视觉读出单元、温度控制器和双18650电池集成到电池供电的便携式读取器中。等温培养单元主要是两个加热垫，设置在加热室底部和盖子上，用于扩增芯片的加热。视觉读出单元是488nm蓝光和塑料发射滤光片。

芯片上采用one-pot扩增，整个反应在密封系统中进行，无需打开盖子，可以有效避免环境气溶胶污染导至的假阳性结果。为了在芯片上快速完成RPA，需要解决两个主要问题，即芯片表面的强非特异性吸附和混合不足。考虑到由于蛋白质在未经处理的PMMA表面上的强烈吸附，RPA反应可能受到抑制，扩增芯片的内表面用2%BSA、寡聚（dT）20和0.2%F127钝化，并将PDMS应用于芯片室的内表面。设计的样品在103拷贝/毫升下扩增后的荧光信号强度有显著提升（图a）。

由于RPA系统相对粘稠，研究团队向反应系统中添加了直径为0.6 mm的4–6个不锈钢珠，以进行搅拌得到更高灵敏度。在相同条件下，不锈钢珠搅拌混合可以加速扩增反应，使荧光强度更高、更均匀，荧光强度的差异具有统计学意义（图b）。

此平台提供了完整的现场测试解决方案。为了评估该平台的性能，开发了一种检测人造细菌或病毒样本的方案。结果显示，可以检测到不同浓度的SARS-CoV-2人工鼻咽拭子样本，LoD显示为低至4×102拷贝/毫升（图d），与PCR方法相当。该POCT平台不仅可用于检测SARS-CoV-2，还可用于检测致癌感染。研究团队用人工设计的幽门螺杆菌样本进行了测试，以评估该平台的性能。LoD显示为低至1×103/毫升（图e），与PCR测试的灵敏度相似，能够检测典型临床唾液样本中的幽门螺杆菌。该便携式平台能够以最少的设备执行整个测试过程，样本到结果的周转时间短于30分钟，是现场诊断测试的理想工具。

鉴于视觉检测偶尔会受到操作员偏差的影响，当样本浓度较低时（通常当浓度接近LoD时），视觉识别变得困难。因此，研究团队开发了一种基于智能手机的辅助荧光分析通道。用户首先用手机的相机拍摄终点的荧光图像。联合开发的移动电话应用程序可以计算阳性对照管和阴性对照管的像素强度分布的比率，并返回指示样本中是否存在目标病原体的结果。人们还可以将图像上传到支持网站。在用户许可的情况下，在线工具可以读取图像的元数据，如时间和坐标，并直接反馈给医疗和卫生机构，以便阳性患者能够快速接受治疗，减少中间环节的隐私泄露。它还可以绘制阳性检测的地理分布和随时间的趋势，允许用户跟踪特定病毒的传播。

本文展示了一个简单的便携式平台，能够在30分钟内快速进行样本测试，以检测致癌微生物（如幽门螺杆菌）或其他病原体（如SARS-CoV-2）。电池供电的便携式读取器集成了恒温培养单元、视觉读取单元和预存储试剂，包括完整的现场诊断测试包。该POCT平台确保了快速的样品-应答周转时间（少于30分钟），SARS-CoV-2的LoD低至4×102拷贝/毫升，幽门螺杆菌的LoD为103/毫升。

此平台在任何地方都需要进一步的改进，包括在家里或室外环境中。首先，在浓缩、试剂添加和结果读取中有几个手动步骤。第二，所有的酶都需要冷藏和冷链运输。此外，便携式阅读器还不够小，不能放在口袋里随身携带。这些限制可能会阻碍报告平台的广泛采用。在未来的工作中，将整合手动步骤，取出冷链传动装置，缩小检测装置，以扩大定制和应用范围。

总之，研究团队开发了一个便携式平台，用于快速、准确地对感染性病原体进行现场诊断测试。该平台的应用将大大促进现场传染性病原体检测，特别是在世界欠发达地区。