如图 1 所示，核酸靶标的检测通常需要样品裂解、核酸提取纯化、核酸扩增和扩增产物分析这几个步骤。
图 1 当面对具体的核酸检测需求时，对样品裂解、核酸提取和扩增检测方法的合理选择与组合，需要统筹考虑众多因素，如样品类型、样品体积、待分析核酸的来源（人的细胞、细菌、病毒等）、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA） 或是核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）分析、检测灵敏度、检测靶标数目等。 没有一种单一固定的方法可以适用所有类型样品的核酸检测。 一、样品裂解 样品裂解是核酸分析的第一步。破坏包裹在核酸外的细胞膜或细胞壁，释放核酸的方法主要包括化学裂解、机械裂解、电裂解和热裂解等方式。 1.1 化学裂解 化学裂解依据裂解样品和细胞的类型而选择对应的化学物质，如用高离液盐、碱溶液、表面活性剂、蛋白酶 Ｋ、溶菌酶等，来溶解破坏细胞膜或细菌壁。
图 2 化学裂解操作简单、条件温和，不需要复杂的配套仪器，但是在后续的核酸提取过程中往往需要清除裂解液中抑制扩增的物质。 1.2 机械裂解 机械裂解是利用机械作用力（剪切力、震荡力、研磨力等），对细胞结构的直接破坏来释放细胞内物质的方法。超声破胞、微珠研磨等都属于机械裂解释放核酸的有效方法。
图 3 其特点是效率较高、速度快，能非特异性地裂解所有细菌细胞且可不引入影响后续扩增的化学试剂，免除了后续清除的麻烦，尤其对于难以破胞的细菌、真菌更是最佳的选择。 1.3 电裂解 电裂解是指利用高强度电场使细胞膜表面产生不可逆孔洞，从而释放胞内物质的方法。 当外界电场施加在细胞上，细胞膜会产生跨膜电压，当该电压超过一定的阈值时，细胞膜就会产生不可逆的损坏，导至细胞的裂解。
图 4 宏观尺度的电裂解需要在样品中直接施加高电压，微观尺度的电裂解需要借助微电极产生的电场作用于细胞上。 电裂解缺点在于电极的工作寿命短，高电压可能导至水解、局部过热以及蛋白变性。 1.4 热裂解 热裂解是通过反复冻融细胞，在细胞膜上形成冰晶，破 坏 细 胞 膜 从 而 释 放 胞 内 核 酸 的 裂 解 方式。这种方法比较耗时，操作繁琐。
图 5 热裂解的另一种方式是利用高温（90-100 ℃） 使细胞壁或细胞膜的蛋白变性，从而破坏细胞。 二、核酸提取纯化 核酸的提取与纯化是为了保证样品中的核酸完整性与纯度，使后续的核酸扩增反应可以顺利进行。 核酸提取方法大致可分为液相提取与固相提取。 2.1 液相提取 液相提取主要有苯酚-氯仿法。苯酚氯仿与样品经过激烈的混合和离心后，生物样品中的蛋白质被苯酚氯仿变性并被萃取到下层的有机相而核酸分子则被保留在上层的水相中。
图 6 该方法由于使用了有毒挥发性有机试剂，对实验者健康有较大影响，因而已逐渐被其他核酸提取方法所取代。 2.2 固相提取 固相提取按照原理分类主要有三种技术方法：凝胶过滤、基于电荷可逆吸附的离子交换色谱法和基于可逆表面吸附的亲和色谱法。 这些方法都能与离心柱或色谱柱结合，后两种方法还能够结合到微珠表面。 凝胶过滤方法的原理：依据核酸分子能够通过特定孔径大小的凝胶，而小分子则会滞留在孔中的特性。交联葡聚糖及其衍生物是最常使用的基质。这种方法无法分离和核酸分子尺寸相近的分子。 离子交换色谱方法的原理：带负电的核酸分子可选择性地结合到被游离平衡离子包围的带电基团表面，未结合的杂质被清洗掉，随后通过大量的游离离子取代核酸分子，与带电基团表面的结合，来释放核酸分子。二乙基氨基乙基纤维素是常用的阴离子交换树脂。 基于可逆表面吸附的亲和色谱法的原理：在高离液盐或高浓度醇的酸性环境中，带负电核酸分子与带负电硅基表面会因高离子强度和氢键而吸附结合；当去除高离液盐或是醇的环境后，核酸会被释放。
图 7 该方法用于核酸提取通常分为四步：裂解、结合、清洗和洗脱。亲和色谱法无需使用有毒试剂，对实验操作人员的伤害少，且操作简单、用时短。 三、核酸扩增 待检测样品中的核酸物质含量通常较低，只有通过核酸扩增才能达到被特异性检出的水平。 核酸扩增技术根据工作温度的不同可分为变温扩增、等温扩增。此外，近年来有别于单一腔体中的扩增技术，数字扩增技术备受亲睐。 3.1 变温扩增 变温扩增技术主要是指PCR。
图 8 3.2 恒温扩增 恒温扩增技术利用生物体的DNA或RNA合成酶，无需温度循环即可实现核酸的扩增，如LAMP、RCA、HDA、RPA等。
图 9 典型的核酸等温扩增技术特点及产物检测方式 3.3 数字扩增 数字扩增是将核酸样品分散到成千上万个独立隔绝的空间中进行大规模的平行核酸扩增反应，然后含有目标核酸片段的微反应空间会经扩增得到荧光信号。 最终通过直接计数或泊松分布公式即可对原始样本的核酸数进行计算。
图 10 四、扩增产物检测 在核酸扩增过程中或完成扩增后，检测扩增产物的量是获取靶标核酸信息的重要步骤。
图 11 常见的核酸信号检测技术有光学检测、电化学检测等。可以根据实验或者诊断的需求选择合适的产物分析技术，从而完成核酸检测。 [1] 便携式全集成核酸分析系统技术综述 免责声明：文章内容仅供参考，不构成投资建议。 |
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