动脉粥样硬化斑块中胆固醇晶体的变化 冯仁丰 最近，我又在美国的临床脂类学杂志中，看到了杂志上刊登的文章“通过结晶摄影观察动脉粥样硬化：在动脉粥样硬化斑块中胆固醇晶体的发展结构如何改变斑块的稳定性”。该文章介绍了很多的胆固醇晶体研究。 文章很长，还涉及了许多病理生理内容。我想借用临床脂类杂志的2020年，刊登的“通过结晶摄影观察动脉粥样硬化：在动脉粥样硬化斑块中胆固醇晶体的发展结构如何改变斑块的稳定性”，将里面多个图片，介绍给大家。这是在胆固醇结晶研究中，最著名的George S. Abela博士写的。
【摘要】 具有动脉粥样硬化病人中降低心血管（CV）事件的残余风险，依然是一个挑战。因此，理解胆固醇如何自发地自组装成亚稳定结构，涉及在动脉粥样硬化斑块内演变为平板胆固醇结晶（CC），以及为什么它们根本地改变了疾病的性质，提供了形成更多治疗的范例。特别是，平板CC，在巨噬细胞的溶酶体内，会成为大至去破裂溶酶体膜，导至组织蛋白酶B释放，和CC碎片直接进入细胞质。在细胞质内，平板CC的表面可以被complosome识别，与组织蛋白酶B一起，触发含有pyrin热蛋白结构域的炎性体。另外，细胞质内平板CC可被补体和在促炎症细胞上的补体和受体识别，较大的片段可诱导“受挫的吞噬作用”，从而使炎症损伤持续存在。此外，在富含脂类的斑块内，亚稳态CC快速转变为大平板CC，可通过斑块坏死核心的扩张，导至创伤性损伤，导至斑块破裂，可能引发进一步的炎症。斑块中的其他结晶，包括尿酸钠和磷酸钙的结晶，可以增强这些过程。因此，进一步限制胆固醇在血管壁上的沉积、减缓平板CC的形成，和抑制晶体诱导的炎症的治疗，可能会进一步降低已确诊CV疾病病人的风险。 尽管现有的治疗有效，但动脉粥样硬化二级预防治疗的最新进展，未能消除心血管（CV）事件的持续风险1-3。更多地了解如何导至发展血管壁（床）中游离胆固醇的积累，动脉粥样硬化斑块的进展和不稳定性，应为开发其他有效治疗策略提供更清晰的依据。 人们认识到，随着脂蛋白在动脉壁中堆积，它们在间质空间中聚集并形成囊泡4.5、或被隔离在巨噬细胞内，巨噬细胞转化为泡沫细胞、并协调持续的低级细胞反应。最终形成简单的纤维粥样斑块，其中含有细胞外胆固醇。有时候，包括中心粒细胞在内的循环白细胞，会被吸引到动脉粥样硬化床中，如果被激活，可能会对包括造成炎症损伤6。此外，通过生长胆固醇晶体（CC）导至斑块核心的快速扩张，可能导至外伤性损伤并甚至破裂7,8。虽然在动脉粥样硬化床中引发和维持炎症和创伤性损伤因子尚未完全确定，但越来越多的证据表明，主要是在常驻的巨噬细胞、间质空间、和富含脂类核心中形成的CC极大地驱动7-10这些过程（图1）。
图1 动脉粥样硬化包括中平板胆固醇晶体的影响。在巨噬细胞中，在溶酶体内的平板CC会大至破坏溶酶体膜，导至组织蛋白酶B（绿点）和CC片段世界释放到细胞质。在细胞质里，平板CC的表面可以被complosome（蓝点）识别，与组织蛋白酶一起会触发NLRP3炎症some。另外，细胞质中平板CC可触发细胞凋亡蛋白酶（红点），激发凋亡。在间质空间，从富含脂类的囊泡和凋亡的巨噬细胞释放的平板CC表面，促进了炎症伤害，由于它们被巨噬细胞的hMincle受体、和被增强炎症小体表达的补体因子C5c和C5b-9识别，促进了选择素的内皮表达，增强IL-1b的趋化作用，并增强循环白细胞的进入。 另外，没有被清道夫细胞摄取的大平板CC，可诱导受阻的吞噬作用，导至持续性炎症。在斑块核心，从凋亡白细胞释放的细胞碎片，可突然改变生理化学环境，加速亚稳态向大量平板CC的转变，导至包括的扩张、血管滋养管出血、和直接损伤，可导至斑块破裂或触发炎症，由于小的CC片段会暴露在间隙空间中。 “通过一个结晶摄影观察动脉粥样硬化”有可能看到，动脉粥样硬化斑块内胆固醇的演变性质，改变了疾病的行为。特别是，它协助解释了动脉粥样硬化斑块内在细胞内和细胞外的游离胆固醇，如何自发地自行组装为亚稳态的CC，为什么它们向平板结构转换易于导至炎症和创伤性伤害成为永久性风险。
图2 从亚稳态到稳定CC的过渡阶段。（图上端）在体外看到经数周形成结晶（分辨率10 μm）。（图下端）体内动脉粥样硬化兔模式内，胆固醇的骨架看来暂时演变为板状。每个阶段变化率受物理化学环境因素的影响。这是对组织进行扫描电子显微镜检查，无需遗传脱水避免溶解CC。相反，组织通过真空脱水，收缩为最小。
图3 结晶过程中胆固醇体积膨大，晶体穿透人冠状动脉和颈动脉的内膜。（A）胆固醇从液体中结晶后在试管边缘上方膨胀（体外）。（B,C）试管中的胆固醇（SEM为扫描电子显微镜）。（D,E,F）CC在试管口（分辨率5 μm）上的纤维膜进行评级。（G,H,I,J,K）为左冠状动脉前降支扫描电子显微镜（中间）低于斑块破裂点。可看到CC穿透内膜表面。（L,M,N）新鲜的颈动脉直接来自手术室，在37℃保存和检查，没有任何组织处理，展现了CC穿孔内膜与上述组织真空脱水的扫描电子显微镜图像相当。Bodipy C-12（invitrogen），一种绿色，对胆固醇具有亲和力的荧光染料，用于突出CC。
（注：图中黄色为胆固醇晶体；红五角星为磷酸钙；黑三角为尿酸钠）。Plaque Rupture：斑块破裂；Vasospasm血管痉挛；Myocardial Injure（心肌伤害）。 图4 与结晶有关的动脉伤害的多步骤概要。1）具有撕裂的纤维帽边缘被栓住的斑块破裂；2）释放的CC向下游移动，破坏内皮并诱发血管痉挛；3）滞留在肌肉中的CC诱导炎症伤害。（bar = 200 μm 光学显微镜；bar = 50 μm 扫描电子显微镜）。
图5 胆固醇结晶栓子引起肌炎。（A）兔左股动脉CC栓塞后的计算机断层扫描图像，保持畅通。（B）48小时PET扫描显示局部炎症（箭头）。（C,D）炎症PET部位的肌肉活检显示巨噬细胞浸润（RAM 11 染色呈棕色）。箭头指向肌肉细胞的收缩坏死。E、荧光显微镜显示巨噬细胞摄取结晶。新鲜样品用Bodipy C-12染色，这是一种对胆固醇具有亲和力的绿色荧光染料，用于突出巨噬细胞内的结晶物质。PET为正电子发射断层扫描。
图6 在急性心肌梗死期间从被伤害的冠状动脉中的抽提物。（A,B,C）SEM展现了急性心肌梗死期间被伤害的冠状动脉抽提物中得到大量的大胆固醇晶体。抽提物被清洗血液，使用组织纤溶酶原激活剂溶解剩余的血栓，使其在空气中干燥。（C,D,E）巨噬细胞附着在看来要被侵蚀的晶体。巨噬细胞延伸附着在胆固醇晶体。（F）巨噬细胞与胆固醇晶体接触，吞没和溶解胆固醇晶体，并开始产生IL-1β、IL-6、和CRP。（G）在急性心肌梗死期间的人冠状动脉抽提物的巨噬细胞，以Bodipy C-12荧光染色，展现了内在化胆固醇晶体物质。
图7 人颈动脉动脉粥样硬化斑块和冠状动脉抽取物中双折射和钙晶体。（A,B）使用相差显微镜看动脉粥样硬化斑块内的晶体。（C）急性心肌梗死病人被伤害的冠状动脉的抽提物中存在磷酸钙晶体（黑色箭头）与胆固醇晶体（白色箭头）交织一起。（D）在（C）样品的能量色散X射线下分光光度分析，展现了高钙和磷酸盐含量、以及碳和氧含量，与胆固醇一致。
图8 服用和未服用他汀的胆固醇结晶形态图像。（A）体外纯胆固醇结晶的扫描电子显微镜图示，显示结晶的尖端；（B）服用普伐他汀展现的blunted不锋利的顶端和较小大小的结晶。（C）未服用他汀的病人颈动脉斑块内的胆固醇结晶，显示形成经典的结晶。（D）服用他汀病人的斑块中变薄，并看来晶体正在溶解。 上述图像，可以让我们有一个较清晰的印象，即确实在动脉粥样硬化中产生了胆固醇晶体。最后那张图，给大家的印象是：出现了冠脉综合征的病人，必须按照医嘱服用他汀药物！凡是服用了他汀的病人，在他们的斑块中的胆固醇晶体变小和变薄了！ |
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