前 言 基于cfDNA和ctDNA甲基化分析的方法为早期检测各种癌症提供了新的途径,DNA甲基化由于其敏感性、特异性和易于分析的特征而具有成为常规临床癌症生物标志物的巨大潜力。多项研究已经成功地证明了单独使用cfDNA甲基化分析进行癌症检测和监测的可行性。 最近几年,国内外已经有多项甲基化检测相关的IVD产品取得注册证,还有更多的相关产品在注册或者开发的路上,小编今天带大家梳理一下甲基化相关产品的注册情况以及甲基化检测试剂临床前研究要点,限于阅历,不正之处欢迎留言交流。 国外甲基化产品的注册情况 2020年《细胞》的子刊《肿瘤进展》(Trends in Cancer) 上发表了题为《Diagnostic Power of DNA Methylation Classifiers for Early Detection of Cancer DNA 甲基化在肿瘤早期鉴定中的表现》的文章(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7188195/),讨论了基于液体活检的DNA甲基化分析在早期癌症无创诊断中的优势,以及目前的商业应用和先进分析方法的开发情况。 其中汇总的国外甲基化产品的注册情况如下 共涉及7家公司关于宫颈癌和口腔癌、结肠癌和肺癌、肠癌(3款)、多发性癌症、(肺癌、乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌)、肝脏、前列腺癌检测相关的9款产品。 国内甲基化产品的注册情况 通过NMPA网站搜索甲基化,我们可以发现目前(截止2022.10.25)已经有16款甲基化检测相关的试剂盒取得注册证,同时审评中心还公布了北京艾克伦医疗科技有限公司的Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化检测试剂盒( PCR-荧光探针法)的审评报告,总计已经取证17款。 另外,2020年深圳市赛尔生物技术有限公司的系统性红斑狼疮(SLE)基因甲基化检测试剂盒(MS-HRM分析法)通过创新审查;广州市基准医疗有限责任公司的人类ONECUT2/VIM基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)最近进行了优先审批公示,都在拿证的路上。 从上面三个统计图可以看出 ➣ 目前已经有12家国内企业取得了甲基化检测相关IVD产品的注册证,其中博尔诚、透景和艾克伦各有两个产品; ➣ 2015-2021年每年只有1-2个产品获证,2022年前十个月已暴增到6个; ➣ 而癌种方面,肠癌单一个癌种已经有9个产品,排名第二的是肺癌有2个,其他膀胱癌、胃癌、胶质瘤和宫颈癌各1个。 2021年之前已经申请指定注册检验的也还有很多,简单列举如下: 而2022年08月19日终止注册审查告知书还包括广州优泽生物技术有限公司的肝癌甲基化基因检测试剂盒(数字PCR法)。 从注册检验、终止审查、创新审查、优先审批和取得注册证等信息,都可以发现已经有越来越多的公司在进入甲基化这一领域。接来下再看看法规、标准和指导原则等方面关于甲基化的信息。 甲基化产品相关法规、标准和指导原则 目前专门针对甲基化产品发布的标准和指导原则不多,小编大概汇集如下: (1)国家标准:GB/T 40183-2021 DNA甲基化的测定焦磷酸测序法 (2)指导原则:人类SDC2基因甲基化检测试剂临床试验资料技术审评要点 (3)审评报告: ▸Septin9/SDC2/BCAT1基因甲基化检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(CSZ2000117) ▸人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)(CSZ1900359) ▸人类SFRP2和SDC2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)(CSZ2100018) ▸SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒(荧光PCR法)(CSZ2100044) ▸SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(CSZ1900370) ▸KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂盒(PCR荧光探针法-胶体金法)(CSZ2000050) ▸RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)(CSZ1900136) ▸人类SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)(CSZ1800035) (4)共性问题:甲基化检测产品在eRPS系统中,体外诊断试剂申请表分类编码6840细化的产品类别名称为23-006。 “eRPS系统中,体外诊断试剂申请表分类编码一栏除固定6840外,增加了对6840细化的产品类别名称,申请人/注册人可在下拉菜单中选择。 23-006:除列入免临床目录的肿瘤标志物以外的其它与肿瘤相关的检测试剂; 本类产品是指除列入免临床目录的肿瘤标志物以外的其他肿瘤相关检测试剂,如甲基化检测等。” 临床前研究要点 在还没有指导原则发布之前,审评中心老师的文章就比较有参考意义了,最后简单摘要包雯老师《肿瘤相关基因甲基化检测试剂临床前研究要点》一文中关于临床前研究的讲述,供大家参考。 肿瘤相关基因甲基化检测试剂企业参考品的设置 此类产品目前尚无适用的国家参考品,企业应在保证产品原材料和生产工艺稳定可靠的基础上,科学合理地设置企业参考品,并相应地进行产品性能验证以及后续的产品检验。 ▸阳性参考品考虑检出能力的验证,建议设置为不同浓度水平的相关适应症患者样本或标准细胞系。 ▸阴性参考品则考虑检测特异性的评价,可为其他相关肿瘤类型的患者样本、其他基因甲基化的样本或标准细胞系等。 ▸ 精密度参考品包含中等强度阳性、弱阳性和阴性水平样本。 ▸ 检出限参考品包含不同背景核酸浓度下、目标基因不同甲基化比例的样本;可采用临床样本或细胞系,基质建议使用临床阴性样本。 注意,不建议采用亚硫酸盐转化的DNA(bisDNA)作为企业参考品的原料。 样本及处理要求 对样本采集与处理的过程进行充分研究,包括样本采集方法、原始样本用量和核酸用量等。建议纳入数十例临床样本,充分评价样本采集、核酸提取和转化过程的精密度。 核酸提取、转化和纯化环节的性能 首先评价核酸提取试剂的提取效率、浓度和纯度。另外对甲基化转化过程进行研究,即转化能力的评价,包括核酸回收率、转化效率和保护效率。建议与焦磷酸测序或其他商业化转化试剂盒进行比较。 注意,须采用临床真实样本充分评价转化前后DNA 的含量、内参基因的量值、各个基因的甲基化状态以及比例等。 测量准确度(accuracy of measurement) 测量准确度包括正确度和精密度,受系统误差和随机误差共同影响。建议综合考虑不精密度和偏倚的影响,首选采用总分析误差较小的对比方法进行比较研究。 ➣ 正确度(trueness) 首选采用与临床诊断结果进行比较研究的方式,评价试剂的诊断灵敏度。或采用与已上市同类产品进行方法学比较研究的方式,通过计算阴阳性符合率和总符合率,评价试剂与同类产品的一致性。如无同类产品,也可采用核酸序列测定方法,如高通量测序或数字PCR法等。 建议使用临床真实样本,纳入不同分期的相关肿瘤适应症样本进行符合性研究,另外纳入其他易转移至原发肿瘤部位的癌症类型、肿瘤部位的其他良性疾病、其他相关肿瘤类型的患者样本对试剂进行特异性评价。 样本可为有明确诊断结果的患者样本或者参考样本盘等。 ➣ 精密度(precision) 即重复性、中间精密度和重现性,主要变量包括操作者、仪器、运行、试剂批次、校准品批次、校准周期、时间、地点等。 建议使用临床样本进行评价,包括阴性、弱阳性以及中等阳性水平的样本。 分析灵敏度(analytical sensitivity) 对于定性检测试剂而言即为最低检测限。选取特定浓度的阳性样本梯度稀释进行最低检 测限的确定。建议设置多个浓度梯度,每个浓度 重复检测不少于 3 次,以 100% 可检出的最低浓度水平作为预设检测限。在此浓度附近制备若干浓度梯度样品,每个浓度至少重复检测 20 次,将具有 95% 阳性检出率的最低浓度作为最低检测限。建议使用临床阴性样本作为基质,充分评价在不同DNA浓度下,试剂对于不同甲基化比例目标基因的检出能力。 样本可为标准细胞系或特定浓度的临床阳性样本。注意应对其甲基化状态进行确认,可采用进行甲基化转化后测序,验证甲基化序列位点的方法。 分析特异性(analytic specificity) ➣ 交叉反应(cross reactivity) 包括具有同源性序列的核酸片段、其他基因甲基化样本等。 ➣ 干扰物质(interference)包括血红蛋白、脂质、胆红素、自身免疫抗体、常用药物及其代谢 物、患者使用的治疗药物、抗凝剂和已有报道的 干扰物质等。 建议对样本中可能存在的内源性及外源性干扰物质进行研究。具体方法为使用多份弱阳性、阳性的临床样本,分别添加医学决定水平浓度的干扰物质(建议为可能存在的最高浓度水平),每个样本重复检测不少于3次,评价待测物的回收率,确定是否产生干扰。 肿瘤相关基因甲基化检测试剂阳性判断值的确定 阳性判断值在鉴别良性与恶性疾病、确定疾病进程等方面具有重要意义。正确制定阳性判断值能够充分体现试剂的临床性能,如诊断准确性等。下述内容包括推荐的研究方案以及采用的样本类型。 对于包含多个肿瘤相关基因甲基化的检测试剂,可分别确定不同单个目标基因和内参基因Ct 值的差值或拷贝数的比值,判定检测结果的阴阳性。在此基础上,采用逻辑回归模型分析,初步建立公式,具体为赋予各个自变量(ΔCt 值)不同的回归系数并计算总体分值,以达到与诊断结果一致性最佳的目的。再根据上述分值进行ROC曲线分析,选择约登指数最大值点或者平衡临床性能最优的灵敏度和特异性界值,从而确定试剂的阳性判断值。其量值单位可为ΔCt 值或者分值。 阳性判断值的确定过程包括建立与确认两个阶段。建议区分训练集和验证集,分别纳入不同的样本子集,以保证算法模型的可靠性。注意采用临床真实样本进行研究,应来源于试剂预期的适用人群以及相关适应症并充分覆盖不同的亚组。样本总数量可为数百例。 另外,考虑到确定阳性判断值时使用的样本对于目标人群的代表性有限,建议通过临床试验进一步确认阳性判断值的准确性。 本文结合国际通用注册申报规范性文件、相关技术指南等,对肿瘤相关基因甲基化检测试剂反应体系研究、分析性能评估以及阳性判断值确定的关键要素进行了初步探讨,期望有助于相关企业更具针对性地进行相关试剂的临床前研究,相应地大幅提高产品的注册申报效率。 |