实验室传统检测与宏基因组二代测序在肺部真菌感染诊断中的应用价值
2022-11-14 14:45|
编辑: 归去来兮|
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摘要: 本文将对mNGS用于肺部真菌感染诊断中常出现的问题进行评述。
本文来源：武永莉, 鲁炳怀. 实验室传统检测与宏基因组二代测序在肺部真菌感染诊断中的应用价值[J]. 华西医学, 2022, 37(8): 1128-1133. doi: 10.7507/1002-0179.202206117.近年来随着实体器官移植、造血干细胞移植和肿瘤化学治疗患者的增多，糖皮质激素与免疫抑制剂的广泛使用，以及重症病毒感染、严重肝肾疾病、糖尿病、血液系统肿瘤等影响免疫功能的疾病发病率升高，侵袭性真菌病，特别是肺部真菌感染逐年升高。肺部真菌感染主要通过临床症状、病史、影像学、实验室病原学检测等诊断，但由于其临床表现并不特异，影像学诊断需要与肺结核、非结核分枝杆菌感染等进行鉴别，加之肺部真菌感染还可能伴有其他细菌或病毒的混合感染或继发感染，导至肺部真菌感染诊断困难。宏基因组二代测序（mNGS）被用于多种临床样本的病原学检测，极大地提高了肺部真菌感染的诊断率，但在样本留取、报告解读及与传统检测方法相结合等方面尚存在一些问题。本文将对mNGS用于肺部真菌感染诊断中常出现的问题进行评述。可引起肺部真菌感染的病原体种类较多，比较常见的包括隐球菌属、曲霉属、毛霉属、肺孢子菌属等。假丝酵母菌属引起的肺部感染较为少见，其主要为真菌入血后播散至肺部所致，胸部CT常表现为肺脏多发性结节样改变。其他致病性真菌包括组织胞浆菌、球孢子菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、马尔尼菲篮状菌等引起的肺部感染则更为少见。肺部真菌感染的实验室诊断方法主要包括以下3类：①病原学诊断方法，如涂片显微镜检、分离培养；②免疫学诊断方法；③分子生物学诊断方法。
1. 病原学诊断方法 （1）显微镜检：显微镜检法方便、快速，不需要特殊仪器设备，适合在各级实验室开展，可在显微镜下直观观察病原菌与炎性细胞的关系，判断是否有组织侵袭。显微镜检法的不足之处在于：
（2）分离培养：部分真菌培养困难，如毛霉目（包括根霉属、毛霉属、横梗霉属、小克银汉霉属以及根毛霉属等）。有时显微镜检可见大量菌丝，但培养阳性率不高。特别是肺穿刺组织样本，由于微生物实验室采用研磨的方法处理标本，常导至毛霉目真菌菌体被损坏，生长困难。而耶氏肺孢子菌在常见的培养肉汤、沙氏培养基、土豆培养基等均不生长。隐球菌属与曲霉属相对容易培养，但曲霉属与毛霉目真菌在周围环境中可见，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植，培养阳性不一定意味着感染，因此，要特别注意区分培养阳性菌株的临床价值。常见肺部感染真菌培养物详见图2。2. 免疫学诊断方法 肺部真菌感染常用的免疫学诊断试验包括1,3-β-D葡聚糖试验（G试验）、半乳甘露聚糖（GM）抗原试验、曲霉免疫球蛋白G抗体试验、隐球菌荚膜多糖抗原试验等。隐球菌荚膜多糖抗原试验在诊断隐球菌感染中具有极重要的价值，灵敏度为55%～97.7%不等，与检测时间、研究纳入人群及试剂有关。曲霉免疫球蛋白G抗体试验在超敏反应性支气管肺曲霉病与慢性肺曲霉病诊断中有较好的应用价值。G试验在肺孢子菌肺炎（PCP）诊断中，以>200 pg/ml为截断值，灵敏度与特异度可分别高达94.8%与86.3%。GM试验主要用于辅助诊断侵袭性肺曲霉病，但激素使用者较中性粒细胞缺乏者该试验更容易出现假阴性。值得注意的是，GM水平升高偶可见于镰刀菌属与荚膜组织胞浆菌感染的患者，临床上应注意甄别。
3. 分子生物学诊断方法 分子生物学诊断方法，即微生物核酸（DNA或RNA）分子鉴定。目前最常见的分子生物学诊断方法是聚合酶链反应，但其在真菌检测中的应用相对较少，主要原因在于真菌的细胞壁较厚，常规方法下核酸提取困难。
近年来，mNGS的出现及临床应用为肺部真菌感染的诊断提供了非常重要的手段，使临床诊断下呼吸道真菌感染的方法更加丰富，具有重要的临床价值。mNGS技术无需对获取的临床样本进行培养，其可直接从样本中提取全部微生物的核酸，然后对提取的核酸构建标准测序文库并进行高通量测序，最后运用生物信息学分析确认各个物种的基因组序列比对，从而得知样品中微生物的种类和丰度。因此，本质上，mNGS同属于分子生物学诊断方法。mNGS在不同真菌感染中的诊断价值略有差异，如果不在核酸提取方面下功夫，其在检查细胞壁较厚、脂质成分较多的真菌类病原微生物时灵敏度有限，检测阴性不能排除感染。三、影响mNGS诊断效率的要素总结及其在肺部真菌感染中的临床应用 1. mNGS对肺部真菌感染送检标本的要求 （1）标本类型：mNGS的送检样本应来自于感染部位，肺部真菌感染是下呼吸道感染，送检样本包括以下类型：支气管肺泡灌洗液（BALF）：总体而言，BALF是下呼吸道感染较为理想的mNGS送检样本。采集BALF样本时还可通过支气管镜观察病变部位，有时甚至可以见到菌团样或脓性分泌物，通常采集此部位的样本最为理想。但当真菌菌丝侵袭并损伤至黏膜下血管壁时，为避免在获取样本时导至血管损伤，在采集标本时须谨慎操作。此外，若患者免疫状况较好，隐球菌属和某些曲霉属等的感染部位肺部病变局限，BALF mNGS未必能检测到病原菌。 痰液样本：痰液样本杂菌多，干扰大，通常不推荐，特别是留取不合格的样本，其诊断价值将大受影响。但若患者无法耐受支气管镜检查等有创操作，可在用清水充分漱口后用力咳出支气管深处的痰液及时送检，注意勿混入鼻咽分泌物。 鼻咽拭子：仅可用来诊断呼吸道病毒、化脓性链球菌等引起的上呼吸道感染或推测下呼吸道感染的病原类型。如果采用mNGS法在鼻咽拭子中检出真菌，说明鼻咽部有真菌定植。 血液样本：若患者病情较重，不能耐受支气管镜或其他侵入性检查，可以采集血液样本进行mNGS检测。原因是肺部真菌感染时，定植或侵袭的病原菌裂解后可释放游离核酸入血，此时可通过检测血液中游离DNA（cfDNA）来推断肺部有无感染。如果血液样本中检出真菌核酸序列，可能是病原菌入血或病原菌cfDNA入血所致，与其他部位的侵袭性真菌感染有较大相关性。因此，cfDNA的阳性结果并不意味着检测到真正的病原菌，无症状人群（22.8%）也可出现cfDNA阳性。 肺组织活检样本或穿刺样本：如果常用样本无法明确肺部真菌感染的病原学来源，或需要病理学检测明确或排除肿瘤、间质性疾病时，可使用肺组织活检样本进行mNGS检测。但须注意，肺组织样本获取代价高，人源序列多，mNGS检测灵敏度有限，在使用mNGS检测的同时还应进行显微镜检、真菌增菌培养、病理学检查，多种手段协同诊断。
（2）采样时机：抗真菌治疗后，病原体死亡，难以采用传统检测方法检出，但DNA可存续一段时间，存续时间与病原体的类别和患者免疫状况有关，通常为2～3周或者更长时间。因此，使用抗真菌药物后一段时间，采用mNGS进行真菌病原检出的阳性率相较传统检测方法依然很高，这是mNGS较常规培养方法的优势所在。因此，短时间使用抗真菌药物后采样进行mNGS检测对检出率的影响并不大，但较长时间使用抗真菌药物则会影响检测结果，检出率会随给药时间延长而下降。
2. mNGS检测真菌报告解读注意事项 读长（reads）数是指测序获得的碱基序列片段的数量。测序平台不同，如Illumina测序与Nanopore测序，读长序列长度也不一致。高读长数意味着匹配到某真菌种或属特异性片段的数量较多，如果结合覆盖率等信息，高读长常指示该真菌核酸存在。由于不同厂家处理流程不同，不同原始样本的人源组织序列数据也相差很大，目前还难以给出判断高低读长数的阈值。mNGS检测阳性可能是感染的病原菌，也可能是正常菌群、一过性定植、样本污染等。应该注意的是，mNGS本质上检测的是核酸，即使正常的无菌部位，也可能检出微生物菌群，呼吸道样本更是如此。而一些病原体很少成为定植菌或污染菌，在结合患者临床情况及病原微生物相关检查的前提下，绝大多数情况下检出即有价值，比如隐球菌属、结核分枝杆菌等。因此，临床mNGS的报告必须结合患者情况进行解读。在解读mNGS报告时，常会发现某一种真菌仅有数个或十几个读长，包括曲霉属、毛霉目，导至临床解读非常困难。出现此种情况可能存在如下可能：真菌细胞壁较厚，核酸提取较为困难。 患者进行抗真菌治疗后，真菌数量下降，此时采集样本进行测序得到的可能是病原菌死亡后裂解的游离核酸片段序列，导至读长数偏低。 mNGS检测过程中，周围环境中的曲霉属、毛霉目等病原菌可能被引入检测流程而造成污染，特别是在核酸提取操作过程中，在最终检测时这些真菌的核酸序列也将被报告，但读长数相对较低。 二代测序时，高能量的单个芯片上要检测多个患者的样本，操作不规范时会造成交叉污染，特别是其中一个样本病原载量很高时。 测序数据与数据库比对时，可能因数据库菌种的特异性序列选择不佳，而出现比对错误，会报告少量错误读长。 原始样本中病原载量低，如细胞内感染菌（如结核分枝杆菌）因释放到体液中的菌量较少而导至检测敏感性偏低，报告中反映为读长较低。
因此，临床工作中，如果检出真菌的读长较少，需结合患者的临床症状、实验室常见检测结果、影像学表现等综合判断。例如，患者免疫状况较好，检测出低读长数耶氏肺孢子菌，影像学无磨玻璃影等特征性表现，G试验无不明原因升高，可暂不考虑PCP诊断。如检出隐球菌低读长数，应首选隐球菌荚膜多糖抗原试验去验证，如为阳性即考虑为肺隐球菌病诊断成立，如为阴性，应结合其他手段，包括BALF或肺组织穿刺行显微镜检与培养等。
3. mNGS在肺部真菌感染诊断中优势和劣势 目前真菌检测的手段相对较少，缺乏如聚合酶链反应、恒温扩增等临床可应用的单重或多重分子诊断方案，此时mNGS技术在诊断肺部真菌感染时就显得尤为重要。例如毛霉目和曲霉属，二者培养时间均较长，毛霉目有时培养较为困难，显微镜检不易区别，但二者所致肺部感染在临床处理措施上存在很大差异。针对这种情况，mNGS体现出其独特的优势。mNGS和传统病原学检测技术各具优势。mNGS的优势在于：48 h内可获得检测结果，且检测结果可精确到菌种。其较分离培养方法耗时短，较显微镜检更准确。 检测的菌种范围可覆盖罕见真菌菌种，如荚膜组织胞浆菌、球孢子菌属等多见于美洲的地方性真菌。这些地方性真菌培养需要数日至数周，国内的大多数检验医师对其认识有限，易造成误诊、漏诊，延误治疗。而对于mNGS而言，只要解决真菌核酸提取困难的问题，同时确保数据库有该类病原的基因，正确诊断并不困难。 对于混合感染或合并基础疾病（如免疫力低下）的患者，mNGS的检出率较传统方法明显升高，可作为传统检测方法阴性的真菌性肺炎患者的补充检测技术。目前，临床常通过mNGS报告可疑致病真菌的核酸序列，实验室再采用不同手段确认mNGS结果是否可靠。
但是，由于真菌细胞壁厚，破壁困难，核酸提取量少，如果mNGS检测过程中不对标本进行特殊处理，其灵敏度并不优于传统的分离培养或显微镜检。且对于不同真菌，mNGS的检测价值并不一致。建议除非特殊情况，否则送检mNGS时，应同时送检传统病原学检测方法，多种手段联合，结果互相验证，再结合患者的病情、免疫状况、影像学表现等，作出正确诊断。肺部真菌感染的检测如果仅依靠mNGS，将会给临床诊断带来很大困惑。如曲霉属、毛霉目等病原体常见于周围环境中或定植于正常人体的呼吸道，mNGS检测阳性并不意味着即为致病菌。国外文献表明，近40%的非肺部真菌感染者的样本中可检测出曲霉属核酸序列。而对于耶氏肺孢子菌感染，传统的病原学检测手段只有显微镜检，无法对其进行体外培养，此时mNGS便可为PCP的病原学诊断提供较大帮助。总之，肺部真菌感染的临床诊断，特别是病原学诊断存在很多挑战。显微镜检、分离培养、免疫学检测以及核酸分子鉴定（如聚合酶链反应）等传统手段能够识别的真菌类别相对较窄，存在耗时、易漏检等缺陷，给快速、准确诊断肺部真菌感染病原体带来巨大挑战，进而导至经验性广谱抗菌药物的滥用。相比之下，mNGS能直接从各种临床标本中快速、准确、全面识别真菌，尤其在鉴定非典型真菌的类群方面明显优于传统培养方法。mNGS技术近年来发展迅速，但仍存在一些亟待解决的问题：①mNGS送检样本中检出的大量人源序列，目前认为可能与机体免疫、炎症状态密切相关，还需对此进行详细分析与研究；②mNGS在检测病原体耐药基因、毒力基因等重要方面尚未成熟；③目前尚未出现高效快捷的厚壁病原体破壁方法及核酸提取技术，降低了mNGS对病原体的检出率；④mNGS的检测流程尚未标准化，不同厂家之间的检测结果差异较大，给报告解读带来很多困难。我们相信，随着以上问题不断深入探讨和解决，mNGS必将为肺部感染真菌的病原学诊断提供更有价值的信息。
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