【冯仁丰】免疫散射比浊法和免疫透射比浊法 4

四、抗原过剩对散射比浊、以及透射比浊都是一个挑战! 为什么？？

抗血清仅含有有限量的抗体（滴度）。在反应混合物中，需要对抗血清作1:10到1:5的稀释，以避免非特异的反应。所以，所有散射比浊和透射比浊检测中，每个反应杯内仅使用10到100μl抗血清。必须对样品进行约1:100的稀释，使分析物浓度低至保持抗体过剩的状态。(但是若稀释度太高，会使分析物浓度低于检出限值。)

这些条件引出了技术要求，如: 仅取3 μl样品加入250 μl 的反应杯！问题：取样的精密度！

解决问题的做法：先对样品作1:10 或 1:50稀释，然后取 20 μl 或 100 μl 的稀释样品。

进行免疫沉淀常规检测的仪器首先需要以下的能力：

a）进行样品稀释的软件和硬件，或对非常小的体积具有非常精密的加样能力。

b) 建立多点校准曲线（具有校准品组合或进行连续稀释和软件处理能力）。

早期的自动分析仪的光度计系统以吸光度和浓度间的线性关系为基础 (Lambert-Beer定律)。

而且，在尚未要求一般分析仪进行免疫散射比浊之前，很多自动分析仪没有样品稀释和建立非线性曲线的能力。

这就是为什么早期设计血浆蛋白测定用的散射比浊系统，必须与光电比色的临床化学分析仪分开的原因。

五、解决抗原过剩的化学方法

其实任何一个检测方法学，都是在不断迎接临床要求中，面对问题进行研究和采取措施下，才得以向前发展的。

检测样品中蛋白质，使用对应抗体；形成抗原抗体复合物；为了是散射比浊甚至包括透射比浊能够顺利完成，引入了聚苯乙烯胶乳为抗体的载体！使抗原抗体复合物的颗粒放大，满足检测方法的要求；但还是需要克服抗原过剩的问题！因为，检测样品来自各个病人，样品中内含的某个蛋白质含量在样品间差异很大。仅仅依靠调整试剂中抗体的用量，还是无法满足检测要求。关键时刻，在免疫检测中，出现使用非离子型的水溶性多聚体！将聚乙二醇加到试剂中，可以极大地增强了抗原抗体形成的效应！这就使原有的抗原抗体沉淀反应“Heidelberger-Kendall曲线”曲线向右延伸，扩大了抗体过剩的范围。反之，扩大了实际的样品中蛋白质的检测范围！参见图17。

图17、PEG 10000多聚体的增强效应

因此，这些方法学的发展，更加促进了使用特定抗体对蛋白质抗原进行检测的沉淀反应的发展！目前，各个试剂厂商，凡是使用抗原抗体复合物沉淀反应的试剂，在它们的试剂配方中，几乎都加入了聚乙二醇等。

以上是我对免疫比浊内容进行学习的体会。

说到这里，还需要考虑，在上世纪90年代，为了在世界上实现使用免疫反应原理，进行各类的蛋白质检测的标准化。在标准化的途径中，非常重要的进展是，世界上终于有了国际上统一认可参考物质，ERM470。没有它谈不上实现全世界临床实验室检测蛋白质的一致性。因此，我将在以后，向大家介绍实现ERM470的历程。

六、总结

1. 可以由透射比浊和散射比浊得到相似的性能和结果。

2. 试剂均由抗血清、多聚体、表面活性剂和缓冲液组成。

3. 对每个蛋白均需要使仪器的应用最佳化（时间！）。

4. 一般的校准曲线均为非线性。应对每个试剂选择正确的数学方式予以处理。

5. 校准品应可溯源至国际标准（如：ERM-DA472，原CRM 470）。

6. 为了使临床化学分析仪适应微量蛋白的检测，使用了胶乳增强方法提高灵敏度。

7. 免疫透射比浊是均相免疫测定，不需要特别的设备，便于每个实验室流程中予以组合。