洞察 | 如何以临床应用为目标设计诊断产品？罗氏亲自下场演示数字PCR设计方案

在我们过往的市场报道和技术文章当中，一直强调，虽然诊疗一体，但对于诊断产品而言，其更类似高科技电子消费品，而不同于药品。对于药品而言，性能（安全性和有效性）是其唯一核心卖点，但是对于诊断产品而言，性能合格的情况下，我们需要根据应用场景去挖掘和设计新功能点，来实现产品的差异化，而不是简单的在这里说，哪项技术更先进。

作为数字PCR领域的后来者，罗氏最近推出其数字LightCycler系统。虽然并未获得先发优势，而且产品在绝对性能上也并不占优（平板vs液滴，往往认为液滴更具有技术含量），但是罗氏通过对将其数字PCR定位于临床肿瘤学领域，并且根据该市场定位设计其独特卖点，这其中包括高样本输入量、六色检测和更容易的定制检测开发等等，帮助其在日益增多的市场中脱颖而出。

好，接下来让我们看看罗氏是如何秀了一把操作的。

罗氏在2018年首次公开了其数字PCR项目，而今年早些时候，该公司对其目标做了进一步的阐述，即数字LightCycler系统将成为目前包括至少四个其他开发商的市场中的竞争者。

上个月推出的研究用数字LightCycler系统拥有六个光学通道和三种不同的板式数字PCR格式，还包括一种名为HiSensitivity的纳米孔板，可以接受45 μL的样本。

罗氏PCR系统生命周期负责人Miriam Fend说：“我们继续将PCR推向更多的应用，数字PCR现在可以让我们的客户进行精确的PCR测试，因为它具有绝对定量和独特的灵敏度。”

数字LightCycler系统是由罗氏研发团队开发的，该公司在产品设计之处的目标就是使它与其他商业产品具备不同的卖点。

目前，商业化的系统包括Bio-Rad实验室的QX Droplet Digital系列仪器、Stilla Technologies Naica系统、Thermo Fisher Scientific QuantStudio Absolute Q数字PCR系统和Qiagen QIAcuity等等。

这些系统在诸如形成PCR液滴的方式、所需仪器的数量、可用光学通道的数量以及整体工作流程和结果时间等方面都有不同。

一些竞争对手系统使用基于乳剂的液滴形成，但罗氏系统是基于平板的。这使它使用起来更简单，扩大了需要更多标准化和更简单工作流程的实验室的使用范围，比如临床实验室。

该系统有一个自动工作流程，把样本分成10万个分区，可以在1.5到3小时内得出结果。而且，它还具有用于数据分析和结果报告的软件，并能与LIS系统连接。

同时，外形也是罗氏品牌的一个关键因素，数字LightCycler系统的外观和感觉与罗氏的其他仪器一样。最后，它完善了该公司的分子系统产品，涵盖了从护理点Liat到高通量Cobas 6800/8800的qPCR产品体系。

现在，罗氏能为客户提供一整套PCR技术，而且其在外观、感觉和用户体验方面均保持一致，这使技术之间的切换更加流畅。

数字PCR的好处是提供量化，而不需要单独的校准步骤，这有助于保存珍贵的样本。多通道系统的多重测定也放大了这一特性。

高精度和多重测定可能有用的一个地方是在临床肿瘤学中测试异质肿瘤样本的基因突变。数字LightCycler系统提供了三种不同的平板耗材，其中一种新颖的深孔平板有可能利用较少的反应实现对低浓度或罕见目标的检测。

2022年4月，罗氏在美国癌症研究协会年会上展示了一张海报，描述了利用数字LightCycler系统的六通道功能和深孔板实现43个靶点、两管同时检测表皮生长因子受体突变的测定。

该团队指出，该测定在同一反应中检测T790M和C797S突变是否处于顺式或反式阶段，还通过检测和量化其他EGFR突变来报告等位基因背景，包括19号外显子的27个缺失和20号外显子的6个插入。

根据海报，这样的测试可以应用于确定非小细胞肺癌患者是否有突变，从而有必要改用第三代酪氨酸激酶抑制剂。

具体来说，使用第一代和第二代TKIs的病人中有一半会出现T790M耐药性突变，然后可以转用第三代TKI，即奥希美替尼（阿斯利康的Tagrisso）。然而，这种后续治疗可能导至EGFR基因中出现C797突变。如果这种突变处于转基因阶段，联合使用第一代和第三代TKIs对这些患者可能有一些好处。

然而，整体的等位基因背景在这种治疗中是否重要还不得而知，罗氏研究人员在海报中说，因此多重表皮生长因子受体突变小组可以成为一种有用的研究工具。

该公司报告说，表皮生长因子受体的多重测定可以检测出频率低至0.1%的无细胞DNA样本中的突变。

去年在《Cancers》杂志上描述了一种类似的数字PCR方法，使用的是Stilla Technologies公司的六色系统和一种24倍的单管EGFR测定。

罗氏还制造了一种qPCR测定，即Cobas EGFR突变检验v2，它能检测总共42个目标，在Stilla的研究中被用作比较器。该测试已被美国食品和药物管理局批准用作五种不同TKI疗法的辅助诊断。

在AACR的海报中，罗氏研究人员将他们的表皮生长因子阵列与Bio-Rad公司的一种称为Bio-Rad专家设计测定的检测方法进行了比较，后者在QX200上运行。他们发现两种测定在检测顺式和反式突变方面的性能相似，但注意到Bio-Rad公司的测定只检测C797S和T790M。

值得注意的是，Bio-Rad公司的QX200系统有两个光学通道，而赛默飞世尔的应用生物系统QuantStudio Absolute Q数字PCR系统有四个光学通道，第五个用于参考。Bio-Rad公司目前还在开发一种名为QX600的六通道、100,000液滴的系统。

与此同时，Qiagen公司的QIAcuity系统有单板仪器，有两个或五个通道，据一位发言人说，该公司还生产四板和八板仪器，其中五个通道是标准通道。

罗氏还与MilliporeSigma公司建立了合作关系，为开发自己的测试的客户开发定制寡核苷酸。而且，尽管该公司目前以临床应用为导向，但该系统也可被客户用于其他应用，如废水测试或生物制药质量控制，如基因和细胞疗法制造。

Fend说：“我们真正认为数字PCR具有最大潜力的地方是进入临床领域，提供肿瘤学和疾病监测测试，而这正是我们罗氏公司真正强大的地方。”

TATAA生物中心的创始人兼CEO Mikael Kubista是数字LightCycler的早期用户之一，他在一封电子邮件中说，他已经测试了该系统大约四个月了。

TATAA Biocenter是一家专注于细胞和基因治疗的合同研究组织，它与数字PCR合作超过15年，提供dPCR测试服务超过10年。

Kubista说：“我们拥有所有领先的dPCR平台，定期向研究界提供实践培训课程。”

该团队还共同编写了dPCR MIQE指南，教研究人员如何计划、执行和报告dPCR研究，它还为最近发布的关于qPCR和dPCR的ISO标准做出了贡献。

因为TATAA生物中心是一个被认可的实验室，它必须对新仪器进行广泛的测试，验证性能并建立工作流程。TATAA还将它们整合到它使用的一个名为Benchling的LIS系统中。

dPCR在TATAA实验室的主要应用是药效学和药代动力学研究、稀有序列检测和标准品的校准。

“我们还在为设计和验证定制的dPCR测定建立标准操作程序。”

在这种情况下，Kubista认为新的罗氏dPCR系统的一个“独特和备受赞赏的特点”是其生物分析分离工作流程的开发模式和规范模式。

“开发模式提供了我们在为客户的PK/PD研究设计和验证定制测定时所需的灵活性，而规范的生物分析模式满足了GLP研究的要求，并在需要时实现了高效的技术和方法转让。”

作为一个熟悉其他商用数字PCR系统的人，Kubista说它们“都不错”，但罗氏系统有一些与众不同的特点。特别是，三种不同的板允许客户进行组合，从而实现成本和性能的进一步优化。

“高灵敏度板可接受约45 μL的总体积，这很重要，因为检测罕见事件的灵敏度与分析的总样本量成正比。此外，高分辨率板有令人印象深刻的10万个分区，而其他仪器上的相应分析通常需要多次运行，成本更高。”

最后，对于进行认可分析并按照GLP或GCLP工作的实验室来说，容易集成到LIS系统中也是“一个关键优势”。

而且，用LightCycler设计定制测定非常简单而且直观，这其中包括基于先进设计的测定，如双尾PCR，它提高了特异性，并允许检测更短的目标。而对于载体基因测试服务和许多诊断应用来说，这一属性至关重要，因为客户经常需要定制化的测定。

而一些dPCR仪器需要专有的复杂母液，这使服务提供商的定制设计变得复杂。

规范的内容和标准化现在将是dPCR仪器之间的一个关键区别因素，为某些诊断应用提供基于验证测定的定制解决方案也将很重要。

Kubista预计dPCR将彻底改变诊断学的几个领域，这其中包括癌症、移植物排斥、无创产前检验以及法医和古遗传学的无细胞DNA分析方面将取得突破。数字PCR有望带来生物学研究的突破，并刺激推进细胞和基因疗法所需的药效学和药代动力学检测的发展。