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技术|一文读懂流式细胞仪

2022-9-15 15:22| 编辑: 归去来兮| 查看: 4671| 评论: 0|来源: 诊断科学 | 作者:认真的刘博

摘要: 自动移液、设置补偿以及允许孔板自动分析可以提高流式细胞仪分析的可靠性。


当涉及到在实验室环境中分析细胞时,流式细胞仪是一种广泛使用和全面的单细胞分析方法。本文概述了什么是流式细胞仪,它如何工作,存在的不同类型,如何分析数据,以及流式细胞仪的未来发展。


01 什么是流式细胞仪?


流式细胞仪是一种用于分析细胞的技术,包括细胞计数、表型、细胞周期评估和生存能力。流式细胞仪中激光器产生的光被样品中的细胞散射,由检测器测量,然后转化为可分析和测量的信号。


02 流式细胞仪是如何工作的?


要开始使用流式细胞仪,第一步是准备要分析的样品。从细胞培养、血液或分解的组织中获得的细胞,应被制成悬浮液。这种细胞悬浮液被分成几个管子进行染色,保留一个未染色细胞的等分量作为对照。其他样品通过加入标记有荧光探针的抗体或染色细胞成分的染料进行染色。


当分析细胞内蛋白质时,首先必须固定细胞(在福尔马林缓冲液中)和通透(用通透剂),以使抗体和染料进入细胞。与抗体或染料孵化后,细胞在缓冲液中被清洗,并重新悬浮在以盐水为基础的缓冲液中进行分析。然后将这些准备好的样品引入流式细胞仪。


流式细胞仪有三个主要组成部分[1]:流体学、光学和电子学。在细胞仪的中央部分,流式细胞,样品材料遇到激发光并散射光,随后被检测系统接收。

图1 | 流式细胞仪的主要组成部分。


1. 流体系统包含鞘液(盐基缓冲液或水),通过机器加压引导细胞样本通过激光,对每个细胞进行单独测量。


2. 光学系统包括激光器和收集光学系统,如光电倍增管(PMTs),收集样品散射的信号。


最后,细胞仪的电子装置将检测到的信号转换成数字参数,可以用软件进行分析。


03 什么是正向散射、侧向散射和荧光信号?


流式细胞仪的三个主要输出测量是正向散射、侧向散射和荧光信号。激光的可见光从每个细胞上反射,提供了细胞的一般大小和形状特征。


图2 | 正向散射,显示了光入射到细胞上时的正向散射。


正向散射(FSC)是来自正向的散射,反映细胞的大小。散射是沿着激光的路径测量的,每个细胞都会在细胞的两侧弯曲光线,导至衍射。因此,FSC的强度反映了细胞的直径。


图3 | 侧向散射,显示了光入射到细胞上时的侧向散射。

侧向散射(SSC)是在激光束90度处测量的散射,反映细胞的颗粒度或复杂性。细胞中的结构会改变进入细胞的光波的方向,导至特定的细胞结构,如颗粒和细胞核,对光线进行折射。SSC越强烈,折射越多,预计细胞内的颗粒度越大。

图4 | 荧光信号图示,表示荧光团被入射光线激发时发生的荧光发射

第三个输出指标是荧光信号。这是激光激发荧光团时发出的光。荧光团是在被激发后能吸收和重新发射光的分子。来自激光光源的光子被荧光体的电子吸收,使它们移动到一个更高的能量状态。然后这些电子作为光子释放能量,回到它们的基态。这些光子的波长受到在此过程中分子相互作用所损失的能量的影响。


每个荧光团都有自己的发射光谱,可能与其他荧光团的光谱部分重叠。荧光团可以用来标记抗体,而抗体又可以与细胞上或细胞中的特定抗原结合,从而检测出抗原,或者可以作为染料直接对细胞进行染色,例如通过与DNA结合。


04 流式细胞仪中使用什么仪器?


至少,一个细胞仪会包含一个激光器、一个检测器和一个流体系统,确保细胞快速流过激光束。多年来,细胞仪中激光器的数量以及检测器的数量和质量都有显著提高。这些发展扩大了可同时检测的标记物的数量。


流式细胞仪可以为特定目的而设计。例如,为了实现样品的高通量,可以加入孔板加载器,以实现对多个样品的快速动手分析。


4.1、流式细胞仪的发展


为了增加多参数分析并允许更深入的评估,其他类型的细胞仪已经被开发出来。


 质谱仪[2](飞行时间质谱仪或cyTOF):这种技术不是用荧光团标记的抗体,而是用重金属离子标签标记的抗体。有超过100种金属探针可供选择,信号重叠度有限,比传统的流式细胞仪可以进行更多的高维分析。因此,用这种技术可以进行深入的表型分析,在免疫学和癌症等研究领域非常有用。与传统流式细胞仪的主要区别是,含有分析用细胞的液滴在流室中被汽化、雾化和电离,而质谱仪则检测产生的离子。离子从样品到检测器的飞行时间被用于分析。


➤ 光谱流式细胞仪[3]:光谱流式细胞仪不是评估每个荧光团的发射峰值,而是使用一系列的检测器来测量每个荧光团的整个光谱。然后用算法分离这些光谱。这允许使用光谱重叠的荧光团来增加一个实验中分析的参数数量。


➤ 细胞成像术[4]:这种类型的细胞术结合了传统的流动和荧光显微镜。该技术还可以评估细胞的形态,并可用于观察蛋白质的共同表达、细胞结合、蛋白质的核转位和免疫细胞突触。


4.2、细胞分拣


荧光激活细胞分拣器(FACS)是一种使用流式细胞仪分拣细胞以进一步分析或实验的设备[1]。而不是只测量细胞特征,而是根据特定的特征选择细胞,并引导其进入收集容器,以净化某些细胞类型的样本。使用FACS的一个例子是,从血液中的外周血单核细胞(PBMCs)样本中获得T细胞。


由于分拣后往往需要进一步培养细胞,因此分拣必须在无菌条件下进行,而且过程要温和,以避免损伤细胞和降低其活力。由于这个原因,细胞分拣不能在质谱中进行,因为会破坏细胞进行分析。分拣器可以是传统的基于流式细胞仪或基于光谱的。


分拣是对某一特定参数呈阳性或阴性的细胞群进行的。利用单细胞样本液流的高频振荡分离细胞,以产生被赋予正电或负电的液滴。然后,液滴根据其电荷被引导到一个收集容器。


05 流式细胞仪的数据是如何分析的?


从收集的流式细胞仪数据中创建直方图和点阵图,以便进行分析。但首先,应采取几个处理步骤,以实现准确的分析。


5.1、选择有活力的单细胞


一般来说,分析将从根据某些特征选择感兴趣的单细胞开始,这是由一个被称为门控的过程完成。分析软件允许用户在某些细胞群周围画线,称为门控,以选择它们进行进一步分析。


对单细胞进行门控是非常重要的,因为双细胞,即同时通过激光的细胞,可能会导至其中一个细胞的假阳性信号。使用显示FSC和SSC数据的点阵图,选择具有感兴趣的群体大小和颗粒度的单细胞进行进一步分析。


此外,必须对存活率进行把关,因为死亡的细胞往往会发出更多的自发荧光,可能会影响分析。自发荧光可能与一些使用的荧光团重叠,导至假阳性信号。存活率是用存活率染料评估的,这些染料可以与DNA结合或与细胞内的游离胺基反应。


5.2、补偿


分析的下一步是评估为每个细胞测量的特定荧光信号。由于可用的荧光团的发射光谱存在重叠,使用多种荧光团的实验可能需要补偿[5]。重叠的光谱可能导至假阳性,因为测量的信号来自另一个荧光团。


因此,适当的实验设计对于构建光谱重叠最小的荧光团面板至关重要。即使如此,也常常需要对重叠进行校正,或补偿。一个阳性和阴性对照样品指导补偿,最好是使用所研究的细胞类型,如果不可能,可以使用补偿珠。


5.3、门控和分析


一旦设置了补偿,可以通过收集每个荧光检测通道的数据来分析每个标记物。可以对感兴趣的群体进行额外的门控,以关注特定参数的存在或不存在。密度图和直方图都可用于此目的。

图5 | 从流式细胞仪实验中产生的密度图和柱状图的示例。


密度图将单个细胞显示为根据其荧光特性分布的点。颜色用来表示分析中具有这些特性的细胞的数量。两个标志物可以同时显示,一个在X轴上,一个在Y轴上,根据这两个参数的表达来区分细胞。直方图显示单一参数,在Y轴上显示细胞数,在X轴上显示荧光强度。


控制对于正确的门控是必不可少的,可以根据阳性和阴性对照来设置。阳性对照是一个表达标记物的细胞样本,由带有感兴趣的荧光团的抗体检测。阴性对照可以是未染色的细胞或用同型对照染色的细胞;一种用分析中使用的荧光团标记的抗体,针对的是细胞上不存在的抗原,以校正非特异性背景。


对于有许多参数的大样本,建议使用荧光减一(FMO)对照。这些对照包括单个流动板的所有荧光标记物减去一个,应该为实验中使用的每一个荧光标记物创建。它允许检测来自重叠光谱图的背景信号。


5.4、高维数据的分析


研究参数数量的扩大改变了流式细胞仪数据的分析方式。每增加一个参数,数据就会获得更多维度。因此,新的分析技术已经被开发出来,以从这些高维数据中提取信息。例如主成分分析(PCA)[6],密度正常化事件的生成树进展分析(SPADE)[7],和t-ochastic neighbor embedding(tSNE)算法[8]。这些算法根据细胞间表型的相似性和差异对数据进行分类,以便进行二维分析。


06 流式细胞仪有哪些应用


流式细胞仪用于细胞生物学,包括在生物制药开发和分析期间,以及更多的临床应用中。


细胞生物学的应用包括:


a) 细胞计数;

b) 细胞周期的分析;

c) 测量存活率;

d) 增殖;

e) 各种细胞类型的表型和随后的细胞分选。


对于(前期)临床应用,流式细胞仪可用于:


a) 检测各种免疫细胞[9];

b) 评估免疫细胞激活后产生的细胞因子以及它们对目标细胞的潜在反应性[10];

c) 深入研究癌细胞和肿瘤微环境中的细胞[11];

d) 检测病毒感染的细胞[12];

e) 评估生育能力分析中精子的特征[13];

f) 监测心脏疾病和脓毒症[14,15];

神经科学研究中的细胞特征[16];


07 流式细胞仪的挑战和局限性


尽管流式细胞仪可以为细胞生物学和临床应用提供优势,但该技术也有一些弊端。系统中的流体可能难以保持一致,细胞或碎片会造成堵塞或影响分析的流速变化。当分析较大的细胞,如癌细胞时,会有特别的风险。


管道中的污染会导至系统被堵塞,流量中断。激光对准也是确保结果一致的关键,应定期检查。额外的限制包括细胞仪有可能对细胞造成损害,影响分析和随后的细胞分类时的培养,以及单细胞分析无法提供组织特征的信息。最后,细胞仪的成本和操作费用,特别是高参数设备,可能很高,限制了它的使用。


08 流式细胞仪的未来


在过去的几十年里,该领域的主要发展使得每个样品中可研究的参数数量大大增加,这些笨重的机器的体积也缩小了。这些发展在未来几年可能会继续下去,只会增加所获数据的复杂性,需要开发软件来规范和验证这些分析。


这一领域的进一步发展将允许在更大范围内进行更广泛的分析,增加每个样本可分析的标记物的数量,并推进数据分析方法,以便对大样本量进行详细分析。仪器尺寸的减少将使其更容易放置在实验室的台面上,甚至可能使其在野外以有限的形式使用。


此外,工作流程的更加标准化将减少用户的错误率,并允许高通量的临床和诊断应用。自动移液、设置补偿以及允许孔板自动分析可以提高流式细胞仪分析的可靠性。


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参考文献


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