立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索
小桔灯网 门户 资讯中心 专栏文章 动力彩虹 查看内容

Nature 子刊丨癌症患者福音:破解单克隆抗体耐药!

2022-8-18 15:00| 编辑: 归去来兮| 查看: 1418| 评论: 0|来源: 小桔灯网 | 作者:动力彩虹

摘要: 由于靶受体的频繁突变,抗体治疗期间获得性耐药性极大地削弱了抗体治疗的有效性。


自1986年FDA批准Muromonab-CD3用于治疗急性器官移植排斥反应以来,单克隆抗体(mAb)已广泛用于治疗各种疾病,如癌症、免疫紊乱和感染。然而,具有不同潜在机制的原发性(从头)或继发性(获得性)耐药性的出现,主要但不限于抗原点突变介导的耐药性、下游信号通路的异常和耐药性相关蛋白的上调表达,破坏了治疗性抗体在靶向治疗中的应用。


西妥昔单抗是一种靶向EGFR的人鼠嵌合IgG1单抗,是第一种获准用于治疗伊立替康难治性和/或奥沙利铂难治性转移性结直肠癌(mCRC)患者的单抗药物。帕尼单抗是完全人IgG2单抗,是另一种针对mCRC的EGFR治疗单抗。西妥昔单抗和帕尼单抗均与表皮生长因子(EGF)竞争,干扰EGFR的下游信号,从而抑制肿瘤细胞的增殖。


对有抗EGFR单克隆抗体治疗史的mCRC患者的临床无细胞DNA(cfDNA)分析显示,一组EGFR 胞外结构域(ECD)突变通过减弱抗EGFR抗体结合介导获得性耐药性,例如,位置V441、S442、R451、I462、S464、G465、K467、K489、I491和S492处的EGFR ECD突变。除R451外,上述所有残基均位于西妥昔单抗和/或帕尼单抗的结合位点。S492R和G465R约占临床获得耐药性病例的20%,是导至抗EGFR抗体耐药性的最常见点突变之一。现阶段逆转点突变驱动的抗EGFR抗体耐药性的策略主要是采用新的抗体组合,例如MM-151和Sym004,以非重叠表位为靶点,这是一种耗时且劳动密集的方法。


近日,来自中国的研究团队在杂志Nature communications上发表了一篇题为“Structure-guided and phage-assisted evolution of a therapeutic anti-EGFR antibody to reverse acquired resistance”的文章,在研究中,研究团队提供了一种结构引导和噬菌体辅助进化(SGAPAE)方法,用于进化亲代抗体西妥昔单抗,以逆转由EGFRS492R或EGFRG465R介导的耐药性,这是西妥昔单抗治疗中最常见的两种抗体耐药性点突变。研究团队使用了SGAPAE方法,有效识别了三种具有最小突变的西妥昔单抗变体(Ctx-VY、Ctx-Y104D和Ctx-W52D),以逆转EGFRS492R或EGFRG465R驱动的西妥昔单抗耐药性,同时在很大程度上保持西妥昔单抗的物理和化学性质,从而确保其可药用性。研究结果表明,SGAPAE方法是一种有效可行的策略,可以克服单突变驱动的耐药性,同时保持亲代抗体的可药用性,是其他生物制剂进化的一种有前途的方法。 


图片来源:Nature communications


主要内容

许多获得性EGFR突变阻断西妥昔单抗和/或帕尼单抗的结合并导至耐药性。


最近的研究表明,转移性结直肠癌(mCRC)患者在西妥昔多抗和/或者帕尼妥单抗治疗后可能获得大量存在于单抗结合表位的EGFR ECD突变,介导了对西妥昔单抗和/或帕尼单抗的获得性耐药性。


流式细胞仪结果显示,一些引入的单突变几乎消除了抗EGFR抗体与EGFR的结合,例如S492R、G465R、S464L或V441D突变显著降低了西妥昔单抗的结合亲和力,G465R、G465E、S464L或S442R突变消除了帕尼单抗与EGFR结合。在有西妥昔单抗或帕尼单抗治疗史的mCRC患者的突变中,S492R和G465R似乎是两种最常见的点突变,约20%的临床耐药患者存在这种突变。对大量结直肠癌患者的III期试验(ASPECCT)血浆样本进行回顾性分析,发现在西妥昔单抗组中,16%的患者出现了EGFR S492R突变(图b)


EGFR外结构域获得性点突变对西妥昔单抗结合能力的影响。图片来源:Nature communications


SGAPAE方法识别西妥昔单抗变体,以逆转EGFRS492R或EGFRG465R耐药性


研究团队使用SGAPAE方法指导西妥昔单抗的进化,以逆转EGFRS492R或EGFRG465R介导的耐药性。基于与西妥昔单抗Fab结合的野生型EGFR的晶体结构,Rosetta平台通过对界面上的残基进行穷举扫描,确定了相互作用的关键残基。通过这种方式,研究团队构建了西妥昔单抗突变体文库,以提高后续噬菌体展示的效率。


研究团队应用基于噬菌体展示的共选择策略来筛选西妥昔scFv突变体,筛选可以结合EGFRG465R或EGFRS492R,同时保持对野生型EGFR的高亲和力的突变体。经过三轮筛选后,从S492R文库中鉴定出两种靶向EGFRS492R的西妥昔scFv变体,并命名为Ctx-VY-scFv(V50Q,CDRH2;Y104V,CDRH3)和Ctx-Y104D-scFv(Y104D,CDRH3)(图b)。从G465R文库中选择另一种靶向EGFRG465R的西妥昔单抗变体,命名为Ctx-W52D-scFv(W52D,CDRH3)。在此基础上,进一步将W52D突变与V50Q/Y104V或Y104D突变相结合,以产生西妥昔单抗变异株Ctx-VWY(V50Q和W52D,CDRH2;Y104V,CDRH3)和Ctx-DD(W52D、CDRH2;Y104 D,CDRH3),以涵盖这些最常见的EGFR突变。


西妥昔单抗变体的表征。图片来源:Nature communications

 

进化的西妥昔单抗变体成功抑制了EGF诱导的EGFRS492R和EGFRG465R激活


西妥昔单抗的主要作用机制是阻断配体诱导的EGFR激活和下游信号,包括通过PI3K/Akt和MAPK/Erk途径的信号,这些信号与许多对肿瘤进展至关重要的过程有关。


在EGF刺激下,WT-EGFR、S492R-EGFR和G465R-EGFR细胞中诱导了EGFR的强烈磷酸化以及下游途径中Akt和Erk的激活。用西妥昔单抗、帕尼单抗、Ctx-VY、Ctx-Y104D或Ctx-W52D预处理将磷酸化EGFR(pEGFR)水平降低至基础水平,并降低细胞中pAkt和pErk的水平(图c)。在S492R-EGFR细胞中,帕尼单抗、Ctx-VY和Ctx-Y104D(而不是西妥昔单抗)消除了EGF诱导的EGFR磷酸化和下游信号转导,这与结合亲和力结果一致。


西妥昔单抗变体抑制肿瘤生长的作用机制。图片来源:Nature communications


西妥昔单抗变体可有效抑制肿瘤细胞增殖


细胞增殖抑制和免疫效应活性是抗肿瘤治疗抗体的重要作用机制。实验结果证明,西妥昔单抗及其变体均抑制表达WT-EGFR细胞的增殖,并显示出类似的体外功效和WT-EGFR结合能力(图b)。在G465-EGFR细胞模型中,西妥昔单抗在抑制EGFR信号传导方面的效力较低,而Ctx-W52D保持其高效力(图b)。在S492R-EGFR细胞模型中,Ctx-VY和Ctx-Y104D表现出相似的抑制效果;然而,西妥昔单抗几乎没有抑制作用。与西妥昔单抗和对照组相比,在G465R-EGFR细胞模型中,仅Ctx-W52D以剂量依赖性方式抑制细胞增殖。


免疫效应活性在治疗性抗体的抗肿瘤活性中也起重要作用。结果表明,西妥昔单抗变体在EGFRWT模型细胞中表现出抗体依赖性细胞毒ADCC和补体依赖性细胞毒性CDC活性,并且在表达EGFRMut的模型细胞中显示出额外的ADCC和CDC活性。


西妥昔单抗变体在体外抑制WT-EGFR和S492R/G465R突变的EGFR细胞的生长。图片来源:Nature communications


西妥昔单抗变体可抑制体内突变型EGFR阳性和WT-EGFR阳性肿瘤的生长


在SW48(WT-EGFR)异种移植物模型中,与PBS组相比,Ctx-VY、Ctx-Y104D、Ctx-W52D和西妥昔单抗组的肿瘤生长受到显著抑制(图b、c)。在西妥昔单抗和西妥昔昔单抗变体治疗期间,未观察到小鼠体重减轻(图d)。在G465R-EGFR-SW48(WT/G465R-EGFR杂合子)异种移植模型中,EGFR G465R受体降低了西妥昔单抗抑制肿瘤生长的效力,而Ctx-W52D在两种异种移植模型中显示出相似的体内功效(图f,g)。EGFR免疫染色显示,在EGFRWT模型中,西妥昔单抗及其变体治疗后,肿瘤内EGFRWT表达下调。在EGFRMut模型中,EGFR的免疫染色显示,西妥昔单抗变异组的细胞内EGFRMut表达下调,而西妥昔单抗组和载体组之间未观察到差异。


西妥昔单抗变体在小鼠体内的抗肿瘤活性。

图片来源:Nature communications


总结与讨论

在本研究中,研究团队成功应用了结构引导和噬菌体辅助进化(SGAPAE)方法来指导西妥昔单抗的进化,成功逆转了EGFR ECD突变引起的获得性耐药性。根据具有S492R突变的EGFR ECD的结构分析和计算预测,在西妥昔单抗的CDR中鉴定了6个关键残基,并创建了一个6个残基的随机噬菌体展示文库。通过筛选表位限制的西妥昔单抗突变体文库后,西妥昔单抗变体Ctx-VY和Ctx-Y104D被鉴定为对EGFRS492R具有恢复的结合亲和力,同时保持其对EGFRWT的结合亲合力。另一种西妥昔单抗变体Ctx-W52D在西妥昔单克隆抗体CDR中具有单一突变,显示其对EGFRG465R具有恢复的结合亲和力。所有西妥昔单抗变体都保持其亲本抗体西妥昔单抗的功能,包括阻断EGFR激活和下游信号、诱导EGFR降解、抑制细胞增殖以及CDC和ADCC活性。总之,这些结果表明,SGAPAE方法有效地实现了西妥昔单抗的表位限制进化,并鉴定了具有最小点突变(1或2)的西妥昔单抗变体,以逆转EGFRS492R或EGFRG465R介导的耐药性。


由于靶受体(例如EGFR和HER2)的频繁突变,抗体治疗期间获得性耐药性极大地削弱了抗体治疗的有效性。SGAPAE方法提供了一种有效可行的策略,在保持亲本抗体的可药物性的同时,克服单突变驱动的耐药性。SGAPAE方法还为有效进化其他蛋白质(如重组酶和细胞因子)提供了一种有前途的策略,由于结构生物学的快速发展,这些蛋白质的结构信息通常丰富且迅速扩展。


声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部