01 选择抗原、抗体、胶乳微球 胶乳比浊试剂研发最重要的步骤就是抗原抗体和胶乳微球的选择。常规生物原料方面，国内的原料厂家已经做得相当不错，性价比高，且货期、售后都更有保证。但遇到特殊项目，就需要在全球范围内寻找了。 抗原抗体的选择主要是对比其特异性。我们需要特异性强的抗体，但并非越强越好。抗体特异性强，灵敏度高。但过高的特异性会导至试剂的信号过高，在高浓度时容易超出仪器的检测限，出现阴阳性区分不开的问题。 选择胶乳微球，主要是对比粒径：粒径越大，灵敏度越高；粒径越小，线性越长。一般情况下，灵敏度大于100ng/mL的，可以试用200nm以下的微球，灵敏度小于100ng/mL的可以先试用200nm以上的微球。当一个微球没办法同时满足灵敏度和线性要求时，可以大球和小球混用，多为小球中混入大球。（注意：相同粒径的微球，也有可能因为表面羧基含量的不同而表现不一样。）。
Diameter 302nm，γ=ug/mg 02 确定反应流程 胶乳比浊试剂不同项目的反应流程大致是一样的，一般分为1步法和2步法。2步法会比1步法多出1-2步离心、重悬的步骤。微球粒径越小，越难离心。所以一般情况下，使用大粒径微球，试剂性能要求高的项目倾向使用2步法，使用小粒径的项目倾向使用1步法。
胶乳试剂的包被有一步法和两步法，其中EDC用量对一步法的影响更大些。下图是一步法中EDC对吸光度的影响。更多的EDC虽然可以提升羧基的活化效率，但过量的EDC会影响抗体活性，造成吸光度的下降。在初次包被时，可以添加100ug/mg-beads的EDC，再逐步调整用量。 为了提升抗体Fc端结合微球的几率，在投料顺序上，可以先加入抗体，混合均匀后再加入EDC进行活化反应（仅限于一步法）。
03 调整反应条件 影响试剂性能的除了前面提到的抗原、抗体和胶乳微球外，还有各步反应的条件，比如PH，活化剂用量，温度，反应时间，溶液的离子强度，抗体用量，封闭缓冲液或者封闭剂的选择等等。每个条件都需要优化到较好的状态且达到平衡，才能长时间的保持试剂性能的稳定。
胶乳比浊试剂的配制常常需要加热，常用温度有37℃、45℃、50℃。温度对灵敏度和线性范围都有影响：如下图所示，在某些项目上，在相同的反应时间下，65℃条件反应在低值可以得到更高的灵敏度，但线性范围远远不如25℃条件反应的效果。
微球和抗体是通过羧基和氨基的化学反应偶联的。溶液的离子强度、PH值等都会影响化学反应的进程。如下图所示，调整包被PH值，可以大幅度提升反应性。 另外，在包被过程中，我们应该尽量避免PH接近抗体的等电点。等电点附近，抗体溶解度下降，容易析出造成微球聚集。
包被、封闭结束后，需要去除多余未反应的蛋白和封闭剂，通常是采用离心的方法。高速离心后需要用超声来让微球均匀悬浮在液体中。超声不足，微球不能充分分散；超声过度，可能造成抗体或者封闭剂从微球表面的脱落，都容易在长期保存中出现聚集、沉淀，造成长期稳定下降。下图对比了包被过程中纯胶乳微球→加入抗体后→包被反应结束后→超声后四个步骤的吸光度变化。可以看到随着抗体、EDC的加入，吸光度逐渐上升，但充分超声后又回到接近纯微球的吸光度。所以选择超声时间时，可以通过紫外分光光度计来确定吸光度变化，当吸光度足够低且稳定后，即可停止。
04 验证试剂性能 试剂性能的验证包括包被结束时和对照试剂的对比以及长期稳定性的监测。一般长期稳定性检测至少要在1年以上。经过1年的低温保存，性能和初始时相差在要求范围内则可认定合格。在化学领域，化学物质在37℃保存1周可以近似于在2-8℃保存1年。但生化试剂中包含各种蛋白质，没有办法简单地将37℃保存1周和2-8℃保存1年划上等号。所以虽然很多厂家会通过37℃-1周的加速实验来快速验证试剂的稳定性，但是提交注册，必须要拿到1年以上的实时稳定性数据。 以上是我们总结的胶乳试剂包被过程中影响性能的常见因素。此外，R2中的表面活性剂、蛋白保护剂，R1的中增感剂等添加剂都会影响最终的试剂性能，也同样需要注意。如果您在操作过程中发现了其他影响包被结果的因素也欢迎留言与我们交流。 |
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