01 多重荧光定量 PCR 技术 1.1 基于荧光探针的多重 PCR 技术 多重荧光定量 PCR (Multiple fluorescencequantitative PCR)技术是在荧光定量 PCR 技术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。 TaqMan 水解探针 (Hydrolysisprobes) 是多重荧光 PCR 体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的 TaqMan 水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。 Weller等 [7] 以 TaqMan 探针为基础，成功构建了两重 PCR扩增和检测体系，Zhang 等 [8] 通过单管逆转录反应成功地实现了对肠病毒 71 型 (EV71)、柯萨奇病毒 A16 (CA16) 以及总肠道病毒 (EVs) 的三重检测。 分子信标 (Molecular beacon) 是多重 PCR 体系中另一种常用的探针，基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET) 的原理，当体系中不存在特异性的靶标时，分子信标会自发形成茎环结构，淬灭基团与荧光基团相互接近从而发生 FRET，不会产生荧光。 如果体系中存在特异性的靶标，在一定的条件下，茎环结构会打开并且与靶标进行复性，从而产生荧光信号。那么在同一个反应体系中加入几种靶标特异性的分子信标就能够实现对多个靶标的同时检测。Vet 等 [9] 针对 4 种不同的靶标设计了 4 种不同的分子信标并且首次在四色荧光 PCR 仪上实现了四重的检测，El-Hajj 等 [10] 利用五色分子信标探针实现了对结核杆菌利福平耐药突变的检测。 1.2 基于探针编码的多重 PCR 技术 基于水解探针和分子信标探针的多重荧光定量 PCR 技术的优点是简便快捷，然而受仪器荧光检测通道的限制，往往最多只能达到四重或五重检测。 组合探针编码 (Combination probecoding) 技术的开发，使得目前的多重实时核酸扩增可检测的靶标数目多于仪器可检测的数目。通过对 4 种不同的荧光基团进行相互组合可以形成15 种指示探针 (图 1)，在多重反应体系中加入多种靶序列特异的置换探针 (Displacing probes)，那么在检测通道有限的情况下仍能够实现对多种不同的靶标同时进行扩增和检测。 Huang 等利用多色组合探针编码技术 (MCPC) 实现了对 8 种食源性病原菌的鉴定以及通过 4 色组合探针编码技术实现了对 15 种不同型别的 HPV 病毒进行分型 [11-12] 。
1.3 基于荧光染料的多重 PCR 技术 非特异性的荧光染料嵌入到 DNA 双链小沟中后，在特定的激发光激发后将会产生一定波长的荧光。 以此为基础发展了熔解曲线 (Meltingcurve) 分析法，利用不同 DNA 序列具有不同 Tm(Melting temperature) 值的特征，在 PCR 反应结束后，通过程序升温使双链逐渐解链成单链，当达到双链特异的 Tm 值所对应的温度时，荧光强度大幅度降低，利用这样的原理可以对 PCR 中不同长度的双链产物或相同长度不同 GC 含量的双链进行分析 (图 2)。 Singh 等 [13] 利用多重实时PCR 熔解曲线分析的方法，成功地实现了同时对氨苄西林、链霉素、磺胺、四环素、氯霉素耐药的沙门氏菌的检测与辨别，Mendes 等 [14] 建立了一种多重熔解曲线分析方法并且实现了对不同基因编码的金属-β-内酰胺酶型别的检测和鉴别。 针对不同的型别设计了特异性的引物对，从而对模板进行扩增生成不同的扩增子，扩增子之间T m 值各有差异，最后通过熔解曲线峰的位置进行鉴别。 在熔解曲线分析技术的基础上发展而来的高分辨率熔解曲线技术是一种利用饱和染料，借助高分辨率的仪器，实现对单个核苷酸熔解温度不同从而形成不同形态熔解曲线，进而对基因进行分析的新技术，它具有极高的灵敏度，能够检测出单个碱基之间的差别，目前主要应用于单核苷酸多态性分析、甲基化分析、基因突变、基因分型等领域 [15-18] 。 |
