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基因检测,如何惠及更多人?

2022-7-28 11:08| 编辑: 归去来兮| 查看: 516| 评论: 0|来源: 新民周刊 | 作者:陈冰

摘要: 这样一个对感染性疾病诊断带来巨大改变的技术,如何更快地应用到临床?


目前,对于医院内的临床实验室而言,由于普遍缺乏生物信息专业人才,仅仅依靠检验人员和临床医生完成生物信息学分析流程的开发、建立、验证、更新和维护极具挑战。

记者|陈 冰
基因检测看上去特别高大上,其实你我他几乎天天都在和它见面。没错,我们非常熟悉的核酸检测就是基因检测的一种。它不仅仅用在病毒检测上,还可以鉴定疾病感染源、预知高发疾病患病风险,检测是否携带先天性遗传疾病基因,帮助肿瘤患者进行个体化医疗……
自1977年第一代基因测序技术出现,到今四十多年时间内,测序技术飞速发展,从第一代发展到了第三代测序技术。测序技术的每一次变革和突破,都会对基因组学研究、疾病医疗研究、药物研发、育种等领域产生巨大的推动作用。
目前,Sanger所发明的第一代测序依然在广泛使用,而高通量测序(High-Throughput Sequencing,HTS)是对传统Sanger测序的革命性变革,因此也被称为新一代测序 (Next Generation Sequencing,NGS)或第二代测序技术。以感染领域为例,病原体宏基因组高通量测序(metagenomic next generation sequencing,mNGS)技术,与传统基于培养学的病原体检测技术相比,能无偏倚地检测各类微生物,包括难以培养的病原体、经验性抗菌药物使用后生长受抑制的病原体,以及新发病原体(如新型冠状病毒),推动精准医疗,挽救病人生命,为人类提供巨大的福祉。
这样一个对感染性疾病诊断带来巨大改变的技术,如何更快地应用到临床?如何让更多的患者因为这一新技术而尽早摆脱疾病痛苦呢?临床专家和企业都正在为此而努力。


新技术给医生一双慧眼


高温席卷全国多个大城市,户外工作的空调清洗工人尤其辛苦,去年盛夏,中国科技大学附属第一医院副院长马筱玲接诊了一名做空调清洗工作的男性病患。入院时患者表现为发热、而后出现咳嗽、呼吸困难、重症肺炎等,病程长,病情重。
医生们采取常规的感染检测,一直没有找到致病的感染源,经验抗菌治疗也没有什么效果。患者已经危在旦夕,医生使用mNGS技术对标本进行检测,发现原来患者是感染了“鹦鹉热衣原体”。
马筱玲说:“鹦鹉热病例多发生于与家禽和鸟类经常接触者,混于尘埃中的鹦鹉热衣原体可经由呼吸道引起吸入性感染;而接触到携带有衣原体的禽(鸟)类及其排泄物等,则可经由破损皮肤或黏膜以及消化道等多种途径获得感染。
这位空调清洗工很幸运,“元凶”被迅速找到,对症下药后他很快就康复了。“不需要使用昂贵的高档抗菌药,节约大量医疗费,这就是mNGS技术带给病人最直接的好处。”
在马筱玲看来,mNGS技术对于检验学科而言,相当于给了医生一双慧眼,是帮助医生及时发现病原体的“哨兵”。
感染性疾病具有相当的复杂性,首先因为病原体本身就是复杂多样的。其次,每一种病菌的用药都是不一样的。感染会发生在人体的各个系统,快速精准诊断,精准治疗,对医生而言是非常困难的一件事情。mNGS可以海量筛查病原体,病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测,特别是对于少见、罕见病原体,新发、突发感染性疾病病原体以及传统技术难培养的病原体,二代测序技术具有独特的优势,能够在最短时间内准确获取病原体的全面信息。
“传统的微生物学是建立在体外分离培养的基础上,而实际上因为多种原因很多病原体难以被培养出来,只能通过二代测序才能被发现。”
马筱玲记忆非常深刻的一个病例是一位从事养猪的男性患者,入院前几天剧烈头疼、发热,表现出明显的脑炎症状。医院进行了几十项病原检测,都未检出致病原。后来用脑脊液标本直接进行二代测序检测,确定为猪疱疹病毒(又称伪狂犬病病毒,PRV)感染。所幸在重症医师团队的精心治疗下,患者转危为安,顺利出院。
猪疱疹病毒是猪感染的病原体,此前一直缺少人类致病的直接证据。2017年,复旦大学华山医院感染科张文宏教授团队,应用二代测序技术在一例眼内炎患者的玻璃体液中检测到PRV,首次证实PRV可以感染人类。

标准、规范还有待完善


2003年,人类认识SARS冠状病毒花了五六个月时间,而2020年新冠疫情发生后,破解新冠病毒国内科学家只用了不到一个月的时间。
北京协和医院检验科主任、北京协和医学院临床检验诊断学系主任徐英春教授指出,在mNGS技术出现之前,如果遇到严重的感染脓毒症患者,往往是各种广谱抗感染的药物一起上。这种没有针对性的“炮轰”式治疗不仅难以有效控制感染,而且容易导至细菌的耐药性。细菌的耐药性问题,已经成为全球关注的焦点问题。
能不能进行一场精准的“狙击战”呢?
2014年6月,《新英格兰杂志》上的论文记载了一场成功的“狙击”——1例6周的住院男孩罹患严重脑炎,进行38项病原检测未检出致病原。发病48小时时用脑脊液标本直接进行二代测序,确定为钩端螺旋体感染,改用青霉素治疗,3周后患者出院。
徐英春说,mNGS作为二代基因测序技术,通过全面分析患者样本中微生物的基因(包括DNA和RNA),识别“坏分子”,可以实现感染性疾病的精准治疗,有效挽救严重感染患者的生命。
但是,恰恰是因为这项新技术具有高敏感性,对技术有很高的要求。相关研究显示, mNGS 检测性能受测序数据量、标本采集质量、人源背景以及环境微生物种类的影响显著,从而可能导至核酸提取不充分、假阳性、中心效应以及生物信息学分析错误等问题,进而影响检测结果的准确性和稳定性。
如何正确解读mNGS测序所给出的证据,以指导临床实践,成为实现感染性疾病精准诊断的重点之一。
“核酸检测为代表的基因检测方法,属于传统的PCR检测,手工操作相对简单。而mNGS复杂的多步骤测试,每个步骤操作是否规范直接影响结果。比方说,南方潮湿,环境中的霉菌等微生物就会比较多,建立数据库的时候就必须充分考虑到这样的不同,以去除环境微生物对检测结果的干扰。”徐英春说,这项技术除了对环境要求非常高,对去人源干扰、去试剂源干扰,都有非常高的技术要求。
传统的培养、显微镜检出,一般能检测出一两种病菌,而mNGS技术一次可以检出十几种或者是几十种微生物的存在,这反而会造成临床医生的困扰,到底哪种微生物才是真正的致病菌呢?“如何解读检测数据,出具临床医生看得懂的报告,并不是一件简单的事情。它需要懂得生物信息分析员、检验医师或有经验的微生物技师和相关专科医师有良好的沟通,才能将一串串代码转化成临床医生看得懂的病菌名称,为后续诊疗确定方向。”
mNGS检测对环境、设备和人员技术能力要求高 。2016年后,国内开展病原体宏基因组高通量测序服务的第三方检验机构数量快速增加。截至目前,国内外 mNGS检测相关试剂获批有限,质量管理体系也在完善中、自动化检测能力也在发展中。

越来越自动化的基因检测实验室让医院内的快速检测得到实现。
徐英春认为,作为一个复杂的病原体分子检测方法,在应用二代测序技术过程中,会遇到很多问题,例如,假阳性/假阴性问题,是感染还是定植?是致病菌还是污染菌?如何在全球范围内共享高质量、实时更新的数据库;如何研发与临床紧密结合的算法,如何确定实验操作规范等等。
此外,目前尚鲜见针对二代测序结果解读的规范,包括序列数阈值,以及灵敏性、特异性评估的统一临床标准等。就像所有其他新技术,在解释数据和报告数据方面仍有很大的困难与挑战。如能进一步规范二代测序在临床感染性疾病中的应用,就可给予临床实践非常重要的线索和信息,协助临床诊断。

医院自建mNGS实验室的探索

十年前,一个mNGS检测的成本约为十几万元,而今已经下降到千元级别。与之相比,完成1次血培养约200多元人民币,完成1次PCR检测则需约80—100元人民币。高成本仍是制约二代测序在国内广泛开展的主要因素之一。
不过随着技术的进一步成熟,二代测序技术的成本大幅下降,mNGS测序技术已越来越多地被应用于重症患者的病原学诊断中。
目前,绝大多数医院未建立自有平台,而是借助第三方服务。随着精准诊疗的需求越来越多,也有不少医院开始自建实验室的尝试。马筱玲所在的中国科技大学附属第一医院就建立了相关实验室,并在最近的诊疗中发现一种很难诊断的巴尔通体菌。
马筱玲指出,目前mNGS本地化主要有医院独立购买体外诊断(in vitro diagnostic products,IVD)产品建设实验室和企业与医院联合共建两种形式。医院独立建设实验室模式在仪器品牌的选择、检验项目的开展和科研方向的发展方面有更强的自主性,可以全面培养人才队伍,但仪器申购程序复杂、购买周期长,相应的辅助设备、耗材和试剂招标较困难。理论上,测试试剂可自行研制,但是大多数医院实验室尚不具备自行生产试剂的平台和能力。因此,企业与医院共建的IVD模式成为很多医院进行尝试的首选。
同济大学教授、附属东方医院南院医学检验科主任吴文娟告诉《新民周刊》,为引领体外诊断领域高质量发展,2021年《医疗器械监督管理条例》指出,国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂,符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要,可以自行研制,在本单位内使用。
为突破国家科技发展的技术瓶颈,2021年7月15日,国务院发布的《关于支持浦东新区高水平改革开放打造社会主义现代化建设引领区的意见》中明确了在浦东新区范围内允许有条件的医疗机构按照相关要求开展自行研制体外诊断试剂试点。随着mNGS自动核酸提取建库仪、智能化生物信息学分析软件等辅助技术的发展,同时为了更好结合临床信息及病情监测,一些医院尝试在本单位实验室完成mNGS检测和结果报告全过程,即“病原体mNGS医院实验室本地化”,东方医院就是其中的先行者之一。
吴文娟指出,医院实验室在建立mNGS检测的过程中,需要分别完成包括样本处理、核酸提取、文库构建和测序步骤的“湿实验”流程以及包括生物信息学分析和结果报告的“干实验”流程的性能评估。其中牵涉到非常多的环节——比方说需要明确不同样本类型的最佳处理方式(储存及运输方式、使用体积及标本性质等),选用的核酸试剂盒对各类微生物提取效率的具体影响,文库构建的核酸输入量和最佳文库浓度,是否需要扩增及扩增循环次数,测序量及测序质量等。当然,还包括一系列实验室的质量控制和风险防范。
“其实,最关键的还是人才。”吴文娟强调,目前,对于医院内的临床实验室而言,由于普遍缺乏生物信息专业人才,仅仅依靠检验人员和临床医生完成生物信息学分析流程的开发、建立、验证、更新和维护极具挑战。一方面,医院需要与相关的公司或科研机构合作,构建并验证一套符合预期用途的本地化mNGS生信分析流程,并对实验室人员进行必要的生物信息学基础理论、流程操作使用及维护等方面的培训,确保日常运行。另外一方面,mNGS结果的解读需要一个由分子生物学、临床感染病学、临床微生物学和生物信息学等专业人员组成的跨学科专业团队,对于疑难病例或复杂的mNGS结果,可以结合患者临床背景资料及其他的实验室检查结果进行综合判断,给出合理的病原学诊断决策。“检验医师作为兼具临床和实验室知识的交叉人才,在医院mNGS本地化开展中将发挥重要作用。我们已经开设了由检验医师执业的检验门诊,也正在加快对检验医师人才梯队的培养。”吴文娟说道。
在不久的将来,随着数据库的同质化、解释标准的确定、核酸提取方案的改进、周转时间的缩短、AI的有效整合以及成本的大幅降低,mNGS将成为临床感染病实验诊断的有力工具之一。“道阻且长,行者将至。mNGS病原体检测已经开启医院本地化建设的新篇章,为精准医疗指明了方向。”

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