文献分享 —— 侵袭性真菌病非培养诊断进展

       Mycopathologia (2021) 186:575–582

       https://doi.org/10.1007/s11046-021-00549-x

前    言

侵袭性真菌病（Invasive Fungal D isease，IFD）通常发生在免疫改变的宿主身上，包括血液病恶性肿瘤患者、获得性免疫缺陷患者、干细胞或器官移植患者和接受长期免疫抑制治疗的患者。IFD的临床表现多样、复杂，通常没有特异表现。加之病原生长缓慢，难以获取及时、准备的病原学依据。

针对IFD现有的诊断手段及其效率都比较低。由于真菌生长缓慢，非培养法的抗原检测和分子学方法成为重要的辅助诊断技术。例如，通过1,3-β-D-葡聚糖和半乳甘露聚糖检测，能够较好辅助IFD的诊断。分子诊断领域也提出了标准化聚合酶链反应（PCR）方法用以检测真菌和抗真菌耐药性的可行技术方案。

抗原检测

一、1,3-β-D-葡聚糖（BDG）

是除隐球菌、芽生菌和毛霉菌外的许多致病真菌的主要细胞壁成分。目前它被用于各种IFD的诊断，特别是侵袭性念珠菌病、曲霉病和肺孢子菌肺炎。血清BDG对诊断肺孢子菌肺炎的敏感性为96%，特异性为84%；对诊断IFD的敏感性为80%，特异性为82%。

BDG检测已经常规应用在血清标本中，而支气管肺泡灌洗液（BALF）和脑脊液（CSF）中测定BDG的方法也在探索中。可能是因为它在一系列致病真菌和环境上的多样性，最新发表的综述中发现BDG检测在BALF和CSF中作为临界或非特异性的真菌标记物，需要额外的生物特异性检测，如分子诊断，以协助IFD的特异性诊断。血清BDG除具有诊断价值外，还可作为预后指标。与BDG检测阳性的患者相比，念珠菌病患者血清BDG持续阴性的患者具有更好的临床转归和预后。值得注意的是，抗真菌治疗期间血清BDG水平的降低可以预测侵袭性念珠菌病和曲霉病治疗是否成功。

二、曲霉菌半乳甘露聚糖

半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）存在于多种真菌的细胞壁中，主要用于诊断侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis，IA）。但是，一些非曲霉类真菌感染，如：镰刀菌病、组织胞浆菌病、蓝状菌病和芽生菌病，可以产生较高的GM水平。

GM可对血清和BALF样本进行检测。血清GM检测可以对高危患者进行间隔监测。与BALF相比，超过70%的中性粒细胞减少患者的血清GM敏感性一般较低。而在非中性粒细胞减少患者中，血清GM的敏感性进一步降低到40%以下。血清和BALF检测的特异性均接近90%。连续的监测GM可用于预测侵袭性曲霉病治疗结果。

三、蓝状菌的免疫检测

一种用于检测马尔尼菲蓝状菌细胞壁半乳蛋白（Mp1p抗原）的新型酶免疫分析法在一项回顾性研究中的结果显示，与血液培养相比，该方法提高了敏感性（86.3%vs. 72.8%）和诊断时间（6小时vs. 6.6天）。

四、新型检测平台

最近，两种侧流检测方法（Lateral Flow Assays，LFA）被用于IA诊断——AspLFD和LFA-IMMY。前者检测曲霉活跃生长期间分泌的胞外甘露蛋白抗原，后者检测半乳甘露聚糖。这种LFA平台的优势在于，与传统的基于实验室的ELISA和分子诊断相比，它们可以作为即时检验在现场部署。

BALF标本的AspLFD诊断IA的敏感性和特异性分别为71-82%和86-96%，而LFA-IMMY的敏感性和特异性分别为92%和91%。血清样本检测时，LFA-IMMY的敏感性和特异性分别为96.9%和98%。在比较中，发现LFA-IMMY的敏感性略高于AspLFD（83-87% vs 69-73%），具有相同的特异性，但具有更好的阴性预测值（89-91% vs 81-82%）。

还有一种更新的方法，是利用尿液检测肺IA的基于半乳糖转移酶的无创单克隆抗体LFA，敏感性为80%，特异性为92%。

隐球菌抗原检测一直是使用乳胶凝集方法。采用LFA技术检测隐球菌抗原具有较高的敏感性、易于使用、需要最小的设置、快速的周转时间和较低的成本等优势。灵敏度和特异性分别为99.3%和99.1%。高血抗原滴度也可预测隐球菌性脑膜炎和死亡率，但是在HIV患者中，滴度与临床疗效没有相关性，因此抗原滴度监测提供的预后价值有限。

分子方法

一、曲霉菌

在最新的EORTC/MSGERC共识定义中，将曲霉PCR检测作为真菌学证据的组成部分。EAPCRI试图通过标准化曲霉PCR方法对标本（全血、血清/血浆、支气管肺泡灌洗液）进行优化，包括确定样本量、提取和洗脱条件以及扩增过程。商品化的曲霉PCR检测具有不同的敏感性，但其特异性通常很高，大约在80%以上。在一项研究中，报告了单一PCR阳性检测的敏感性和特异性分别为76.8- 88%和75-94.5%;两项阳性检测显著提高了特异性，从76提高到95%。

二、隐球菌

最近，FilmArray推出一种直接对脑脊液样本进行的多重PCR检测。其中隐球菌是一个检测目标，已被用于诊断隐球菌脑膜炎。在系统综述中，PCR检测对隐球菌病的检测具有较高的阳性预测价值，如果患者已经接受了治疗则会出现较高比例的假阴性结果。在临床高度怀疑的情况下，即使PCR结果为阴性，仍应进行隐球菌抗原检测。

三、毛霉菌

毛霉病通常很难诊断，并与高发病率和死亡率相关。

MucorGenius®是一个新开发的多重实时PCR产品，可用于检测BALF、组织和血清样本中根霉菌、毛霉属、恒梗霉属、小克银汉霉属和根毛霉属。 在一项10例肺毛霉病确诊患者的小型回顾性研究中，MucorGenius®对肺标本进行检测，灵敏度和特异性分别为90%和97.9%。在另一项回顾性研究中，该方法也能够检测侵袭性毛霉病患者血液中的循环毛霉DNA，总体灵敏度为75%。更重要的是，在第一次培养结果阳性前81天（中位数8天，IQR 1.75-16.25），在放射学证据显示有侵袭性疾病前24天（中位数3天，IQR - 0.25-8.5），患者可检测到阳性结果。

四、假丝酵母

念珠菌核酸检测试验，T2Candida（T2 Biosystems, Lexington, MA）是一种完全自动化的、基于PCR的新型系统。通过T2磁共振检测，将遗传物质与超顺磁纳米颗粒杂交。该平台主要检测致病性念珠菌（白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、耳念珠菌）。可在5小时内直接从全血样本中提取核酸并检测。

最近的一项meta分析显示，T2Candida的综合敏感性和特异性分别为0.91（95% CI: 0.88-0.94）和0.94（95% CI: 0.93-0.95）。重要的是，T2Candida在已经接受抗真菌治疗的患者中具有优势，其阴性预测值高达98%以上，可作为排除念珠菌感染的一种手段。虽然T2Candida系统已被证明优于传统的诊断方法，包括血液培养和BDG，但其主要缺点是对硬件设置的要求和较高的检测成本。

五、耐药性

抗原检测和分子方法可用来确定是否存在侵袭性真菌感染。然而，其中一个限制是大多数无法识别耐药性的存在。对某些酵母和霉菌进行物种水平的鉴定可能有助于获得与之相关的内在抗药性，但对获得性抗药性则没有帮助。获得性抗真菌耐药性因“株”而异。因为念珠菌的培养方法检测抗真菌药敏试验是最成熟的，目前还没有商业化的试剂盒用于鉴定念珠菌的耐药性特征。在霉菌中，烟曲霉获得性唑耐药性被报道的最多。至少两个商品化试剂盒：AsperGenius®和MycoGenie®，针对 cyp51A基因突变的检测。然而，他们在识别各种突变的敏感性方面的表现是不稳定的。

组合检测

组合各类相关检测，可优化IFD的诊断。一种基于生物标志物的策略，结合血液中半乳甘露聚糖曲霉和PCR检测（与传统的培养/病理学或仅使用半乳甘露聚糖相比）来指导移植和白血病患者的经验抗真菌治疗，显著减少了抗真菌药物的使用或可早期诊断IA。

关于BDG、PCR、GM或Asp-LFD测试在各种组合中的数据各不相同且不明确。在侵袭性念珠菌病或腹腔内念珠菌病的情况下，T2Candida敏感性也可能受到影响，结合抗原检测（BDG、甘露聚糖）和常规培养可提高诊出率。

宏基因组学

新一代测序技术将不可避免地在微生物诊断中发挥作用。NGS从临床标本中鉴定真菌的能力可以大大提高非培养诊断的敏感性。一项研究表明，从BALF中检测芽生菌、蓝状菌、曲霉等真菌在技术上是可行的。在ICU或肺移植患者的BAL中经常发现念珠菌和/或曲霉。然而，它们的存在并不预示着侵入性疾病，而且来自念珠菌病患者的定植菌株和侵入性念珠菌菌株并不总是一致的。在检测时，定殖和感染之间的区别仍将取决于临床分析判断。未来，我们进一步甄别和解释mNGS结果回报、降低成本和缩短临床标本周转时间的能力将决定NGS最终何时能在临床诊断实验室广泛开展。

总结

基于培养的真菌检测方法仍然是诊断IFD的金标准。然而，这正被越来越多的诊断真菌感染的替代试验所补充，包括抗原和分子检测，以及联合检测（图1）。新的检测方法在纳入诊断方法之前应该严格验证。临床医生需要了解这些检测方法的临床应用和优点，以及它们的局限性。重要的是，这些检查的使用和对其结果的解释应始终与病人的临床表现和影像学评估相结合。

图1. 侵袭性真菌病的非培养、非组织学诊断模式。阴影: EORTC-MSG推荐作为IFD真菌学证据的检测。