CRISPR技术从编辑到诊断的演变（二）

将晶体管与CRISPR 相结合

    利用新的 Cas 酶并不是创建CRISPR 的诊断工具的唯一方法。Kiana Aran 是加利福尼亚州凯克研究生院的副教授兼小组组长，也是Cardea Bio 的 CSO。该公司前身为成立于2013年的Nanomedical
Diagnostics，旨在开发使用石墨烯的电子生物传感器。在2017 年加入凯克研究所后，Aran开始与现在的Cardea Bio 合作，生产该公司的生物信号处理单元(BPU)。这是使用石墨烯而不是硅的下一代电子晶体管，可以接收各种生物信号。“石墨烯对生物学更友好，”Aran解释说，“生物学不会影响它，而且它非常敏感。”

    BPU 可以适应多种不同的检测分子，包括 CRISPR。正如 2019年 Nature
Biomedical Engineering 出版物中所描述，Aran和同事在芯片上添加了固定化和催化失活的CRISPR-Cas9，从而可以靶向特定的基因序列。该技术的第一个实验测试了来自杜氏肌营养不良症患者的具有两个不同缺失突变的DNA 样本。芯片在15 分钟内识别出具有正确目标序列，而无需进行DNA 扩增步骤。

    然而，他们最初使用的 Cas9 酶无法检测到较小的突变。“2021年，我们与Virginijus Siksnys 博士合作，他是CRISPR 的先驱之一，也是我的密切合作者，”Aran说。Siksnys 向 Aran 介绍了一个不同的Cas9 变体，它对单点突变更敏感，并且能够发现那些导至镰状细胞病和肌萎缩侧索硬化症(ALS) 的突变。“他们有一个不同的Cas 酶库，每个都有不同的功能。有些可以在更高的温度下运行，有些对单点突变更敏感，还有很多其他特性。他帮助我们选择了最适合我们应用的酶。”这些只是该技术的一些可能用途，Aran和她的同事希望它在癌症等领域有用。 “对于液体活检，如果想要检测游离循环DNA 或 RNA，不仅对检测‘是’和‘否’感兴趣，还应该对测试量有多少感兴趣，以便查看是否对治疗有效。”

    Cardea 技术还具有与 CRISPR 相关的其他用途，它可以测试出反应在不同部分与不同的复合物和酶组合的有效性。就在上个月，Cardea成立了一家名为CRISPR-QC 的衍生公司，公司专注于帮助使用CRISPR 的研究人员和公司技术，例如，那些开发医学基因编辑疗法的人，以改进和提高他们的实验质量。

新冠病毒效应

    自 2020 年以来，世界发生了变化。我们都经历了一场全球大流行，疫苗、治疗和有效诊断的重要性从未如此清晰。从历史上看，诊断一直是一项难以掌握的业务。 “我们知道诊断推动了临床环境中70% 的决策。但只有2% 的总预算和医疗保健系统用于诊断，”Dantas
Lemberg 解释说。

    LAMP（环介导等温扩增）和抗原测试很常见。自疫情流行开始以来，与生命科学领域的许多公司一样，专注于诊断或相关领域的公司很快就开始开发针对SARS-CoV-2 的测试。Sherlock 于 2020 年 5 月凭借其快速CRISPR SARS-CoV-2 检测试剂盒在医疗环境中获得了FDA 的首个批准，尽管是紧急使用授权(EUA) 而不是标准批准。今年，Mammoth也以其高通量SARS-CoV-2 测试实现了EUA，该测试将CRISPR 技术与实验室自动化结合进行诊断测试。

    许多新的初创公司决定在COVID 疫苗、药物和诊断方法方面进行新的尝试。Proof Diagnostics 就是这样一家公司。2020 年初，张锋、Jonathan
Gootenberg 和 Omar
Abudayyeh，原来都是Sherlock 的创始人，他们决定成立一家新公司，基于他们在SHERLOCK 的测试，将其商业化并构建一种新型的POCT，易于使用的CRISPR 诊断。“在这非常糟糕的两年半时间里，已经看到来自公共部门和私募的更多投资进入该领域，”Proof首席执行官Sid Shenai 说。 “五年前不是这样，并没有很多投资者关注诊断。”

    在过去的几年里，Cameron Myhrvold 利用他在病毒学经验，以及在 Broad Institute 教授 Pardis Sabeti（也是 Sherlock 联合创始人）的实验室中作为博士生获得的知识，将他的专业知识应用于开发CRISPR的 COVID 测试。Myhrvold 自成为博士后以来一直研究Cas13，现在普林斯顿拥有自己的实验室，专注于使用CRISPR 研究病毒和宿主RNA。在普林斯顿大学之前，Myhrvold与 Sabeti及其团队合作，帮助开发了一种同时测试多种病原体的技术，称为用于核酸多重评估的组合阵列反应(CARMEN)。通过将CARMEN 与 Cas13 相结合，Myhrvold及其同事能够在单个阵列上测试4500 多个目标。

    在大流行期间，Myhrvold 和他的团队调整了CARMEN 早期的工作，以帮助测试不同的SARS-CoV-2 毒株。微流控(m)CARMEN 结合了基于CRISPR 的诊断和微流控技术，可以检测多达21 种病毒，包括SARS-CoV-2 的变体。 ”

预测未来

    分子诊断过去和现在仍然由传统且经过充分验证的技术主导，例如 PCR（聚合酶链式反应）或逆转录酶 RT-PCR。然而，CRISPR技术确实比旧技术具有优势。例如，它具有高度特异性，无需耗时的热扩增步骤和昂贵的PCR仪器即可进行。

    由于大流行，大量时间和投资投入到开发新的诊断技术上，包括由 CRISPR 提供支持的测试。“在一家诊断公司，你需要销售产品，你的价值是你产生的收入的直接倍数，而在一家治疗公司，你可以卖几十年的希望，”Collins说。 “如果不接触产品，就无法在诊断领域做到这一点。”

    CRISPR 诊断提供的更高准确性结果，至少在纸面上非常有吸引力，但在大流行期间广泛使用的侧向层析抗原测试告诉我们，便利性和最低成本可以赢得更高的准确性。即使PCR 和 RT-PCR测试作为“金标准”，在市场竞争中也面临困难，因为这些测试已经非常成熟。

    Eric Rhodes 是 ERS Genomics的首席执行官，该公司由Charpentier 成立，授权加利福尼亚大学、维也纳大学和Emmanuelle Charpentier (CVC) 拥有的专利。 “我认为在某些应用中你会想要使用CRISPR 之类的技术，它可能比PCR 所需的扩增更有优势。但出于各种原因，我认为它不会取代PCR 技术和测序技术，”Rhodes说。

    Myhrvold 对 CRISPR 诊断的发展充满希望，但承认在成为现实之前，需要克服许多挑战 “一个是样品处理，确保高质量的样本进入测试本身是具有挑战性的。很多事情在一开始就可能出错，这使得无论技术有多好，都无法获得好的结果，”他解释道。

    “我们知道诊断推动了临床环境中70% 的决策制定。但只有2% 的总预算和医疗保健系统用于诊断。“我认为，另一个大问题是制造业，这对许多新技术来说是一个挑战。需要大规模生产来降低成本。可以使用更小型的设备，但现在成本是否高得令人望而却步。

    这并不重要，重要的是要记住，基于 CRISPR 的诊断还处于早期阶段，它仅出现了 5-6 年，仍处于开发的早期阶段。 “有第一代 CRISPR 诊断，还有第二代……我们正努力成为下一代基因编辑诊断的领导者，”Shenai说。

    Dantas Lemburg 也对未来充满希望。“我真的认为是时候做出改变了。我认为当今世界更倾向于接受新技术。我认为 CRISPR 已经展示了它的能力，它可以做什么。我真的相信我们正在创造下一代分子测试。”

完