9分钟，98%准确率！自动无扩增RNA检测平台

自2019年12月新型冠状病毒SARS-CoV-2传播以来，已经过去了两年多，但感染的发生率并未减少。从公共卫生的角度来看，对感染者进行早期诊断和隔离可有效防止感染的传播。快速、敏感和频繁的检测对于早期诊断很重要。对于SARS-CoV-2感染的诊断，逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）由于其高灵敏度（~ 2–20am,（1-10 copies/ul））已被用作“金标准”平台。此外，基于CRISPR的核酸检测方法，如SHERLOCK和DETECTR，由于其高灵敏度（~ 2–20am,（1-10 copies/ul）），相对较短的分析时间（几十分钟），并与紧凑的检测平台兼容亦引起关注。大多数基于CRISPR的方法涉及目标核酸的等温扩增，以及使用Cas12a或Cas13a对扩增的核酸进行荧光或比色读出。扩增步骤对于提高检测灵敏度是必不可少的，但它会延长检测时间（至少几十分钟）。

不久之前，研究团队将基于CRISPR的核酸检测和微反应室技术相结合，开发了一个称为SATORI（基于CRISPR的无扩增数字RNA检测）的无扩增RNA检测平台。SATORI可在5min内检测到单链RNA（ssRNA），如SARS-CoV-2 RNA，分析检测限（LoD）约为5fm（3X103 copies/ul），能够在大多数患者临床标本中快速诊断SARS-CoV-2 RNA感染。然而，当用于高效筛查时，LoD应<10 2copies/ul。此外，SATORI还包含几个手动处理步骤，这些步骤可能会导至人为错误并降低分析精度。

近日，为了解决这些问题，同一个研究团队在杂志Communications Biology 上发表了一篇题为“Automated amplification-free digital RNA detection platform for rapid and sensitive SARS-CoV-2 diagnosis”的文章，在文章中，研究团队开发了SATORI的全自动版本，称为SATORI自动化平台（opn-SATORI）。实验结果证明，opn-SATORI可以在临床标本中检测SARS-CoV-2 RNA，其灵敏度与RT-qPCR相当，并且可以在约9min内区分SARS-CoV-2变体，准确率为98%。

图片来源：Communications Biology

为了自动化SATORI检测流程，研究团队开发了一个RNA检测平台，该平台由三个主要组件组成：compact disk（CD）设备、荧光显微镜和机器人（图a）。基于CD的设备包含约10 8个圆柱形飞升级微反应室。与其他数字检测方法不同，opn-SATORI的CD设备不需要微流控通道中复杂的溶液交换过程，可以以全自动方式完成从样品混合到图像分析（图b）。开发的平台自动启用以下检测过程：（i）通过在试管中将含有预装Cas13a crRNA复合物和荧光猝灭基团标记的ssRNA reporters（FQ reporter）的酶溶液与含有crRNA互补ssRNA靶标（tgRNA）的样品溶液混合，制备反应溶液，（ii）将反应溶液滴入CD装置上的小室，（iii）用一滴油密封小室，（iv）积累来自Cas13a介导的FQ reporter裂解（反式裂解），（v）使用荧光显微镜从约500000个微反应室获取图像，以及（vi）计数荧光（阳性）小室的数量，以量化样本中的tgRNA拷贝数（图c）。整个过程可以自动重复，并且可以使用单个反应分析48个样本。

无扩增数字RNA检测的自动化平台。

图片来源：Communications Biology

为了提高检测灵敏度，研究团队筛选了Cas13a同源序列并优化了缓冲条件。LwaCas13a和LbuCas13a因其强大的反式切割活性而被用于基于CRISPR的核酸检测。此外，LtrCas13a与LwaCas13a和LbuCas13a高度同源，并与LwaCas13a具有类似的抑制细菌生长的作用。结果表明，使用LtrCas13a及Ltr缓冲液时，阳性小室数量最多，且随着tgRNA浓度（300aM–300fM）增高，Ltr缓冲液中阳性小室的数量呈线性增加。在试验开始后约7分钟（油封后3分钟），LtrCas13a检测到SARS-CoV-2的N基因RNA和全基因组RNA，LoD值分别为220和280 aM（1.3×102和1.7×102copies/ul）。鉴于所获得的快速、灵敏和稳健的反式切割活性，LTRCA13A和Ltr缓冲液的组合最适合用于此RNA检测平台。

由于平台检测总体积约为15 nL（500000×~30fL）的微室阵列中随机捕获的tgRNA分子，超过99%的tgRNA分子在油封过程中被丢弃，从而导至灵敏度降低。为了克服这一缺点并进一步提高灵敏度，研究团队使用生物素-链霉亲和素磁珠技术在微腔内富集tgRNA分子。将包被链霉亲和素的磁珠添加到含有生物素标记的LtrCas13a crRNA复合物、tgRNAs和FQ reporter的反应溶液中，以捕获磁珠上的LtrCas13a-crRNA -tgRNA复合物，随后将混合物滴到CD设备上，通过磁力将复合物浓缩到腔室中，并用油密封腔室（图a）。该程序在5min内自动完成，与未经磁珠处理的程序相比，阳性小室的数量增加了约50倍（图b），表明LtrCas13a-crRNA-tgRNA复合物在微室中成功富集。在试验开始后约9分钟（油封后3分钟），平台检测到SARS-CoV-2的N基因RNA和全基因组RNA，LoD值分别为2.4和6.5aM（1.4和3.9 copies/ul）（图d）。

Opn-SATORI平台。 

图片来源：Communications Biology

研究团队试图使用opn-SATORI来区分SARS-CoV-2变体。针对相应的变异毒株，即B.1.1.7（α）、B.1.351（β）和B.1.617（δ）中的N501Y、E484K和L452Rspike突变，各设计了20个crRNA，并进行比较筛选。结果显示，在试验开始后约9分钟内（油封后3分钟），WT SARS-CoV-2与每个变体之间的比率存在显著差异，从而能够快速准确地识别SARS-CoV-2变体。不仅如此，B.1.1.529（ο）变体也可以准确区分。总之，这些结果表明，使用opn SATORI和针对特定突变的适当crRNA对可以检测新出现的SARS-CoV-2变体。

SARS-CoV-2变异株的鉴别。

图片来源：Communications Biology

研究团队验证了opn-SATORI是否可用于诊断SARS-CoV-2感染。使用靶向N基因RNA的crRNA，研究团队评估了来自Ct值为15–30（10 WT、10 alpha、10 Japan、10 delta和10 omicron变体）患者的50份人类鼻咽拭子衍生RNA样本和来自健康人的10份RNA样本。样品的阳性室数与RT-qPCR测定的拷贝数（Ct值）相关性良好，相关系数为0.60（图c）。此外，Bland–Altman分析表明，opn-SATORI和RT-qPCR获得的结果具有良好的一致性。opn-SATORI区分了SARS-CoV-2阳性和阴性样本，准确率为98%，阳性准确率为100%。

此外，研究团队通过检测N501Y、E484K、L452R和Q493R/G496S/Q498R spike突变来进行变体鉴别，这些突变已通过全基因组测序（WGS）确认。结果表明，在上述临床样本中检测到N501Y、E484K、L452R和Q493R/G496S/Q498R突变，分别与WGS结果100%、100%、90%和100%一致，从而能够以98%的准确率鉴别SARS-CoV-2变异毒株。这些结果证明了opn-SATORI在快速准确诊断SARS-CoV-2感染方面的潜力。

临床验证。图片来源：Communications Biology

在这里，研究团队证明了opn-SATORI是一个敏感、快速和自动化的ssRNA检测平台，可以精确诊断SARS-CoV-2及其变体。研究团队将生物素-链霉亲和素磁珠技术集成到平台中，大大提高了opn-SATORI的检测灵敏度。获得的灵敏度（LoD为2.4aM（1.4 copies/ul）比抗原检测高1000倍以上（～17 fM（1.0×10 4copies/ul），并与RT-qPCR（约2-20 aM（约1-10 copies/ul））相当。Opn-SATORI检测SARS-CoV-2 RNA无需扩增，在约9分钟内就能完成检测（从样本混合到图像分析的时间），而RT-qPCR和其他基于CRISPR的方法至少需要几十分钟的检测时间。SATORI基本上不受人类拭子污染物的影响，这表明opn-SATORI可以通过无核酸提取程序而更快、更简单地发挥作用。使用opn-SATORI和适当的crRNA对可以识别单个基因突变，并以高特异性（98%）区分SARS-CoV-2变体。在几天内，研究团队就完成了从针对B.1.1.529（ο）变异体中spike突变的crRNAs设计到成功识别变异体的所有过程，突出了opn-SATORI在有效筛查新出现的SARS-CoV-2变异体方面的效用。

Opn-SATORI的使用可以在社会上实施，并广泛应用于城镇诊所、机场检疫站和其他地方。Opn-SATORI（传统的基于CD的器件）的器件制造成本约为0.01美元/次，检测试剂的成本约为每项检测2美元，与RT-qPCR和抗原检测的成本相当（每项检测1.21-4.39美元）。

由于opn-SATORI平台使用机器人和荧光显微镜，并且相对较大，因此开发一个更紧凑的通用平台非常重要。鉴于基于CRISPR-Cas13a的方法已用于癌症诊断中的miRNA检测，opn SATORI可作为多种应用的多功能平台，包括诊断病毒感染和评估液体活检的疾病相关生物标记物。