技术｜引物和探针的制备方法一览

有多种方法可以合成引物和探针。引物和探针都可以被提供一个标签。这个标签可以在报告基团的帮助下进行直接检测或可视化。

引物和探针被设计成单链核苷酸（所谓的寡聚物），通过化学合成获得，长度在6到100个碱基之间变化。大多数寡聚物的长度为19 ~ 25个核苷酸。最常见的方法是磷酰胺合成，通过这种方法，带有活性基团的单个核苷酸按照预定的顺序一个碱基接一个碱基地自发反应。引物和探针在合成过程中可以在任何需要的位置进行标记，将正常的核苷酸变成类似物，例如用FITC-12-dUTP、DIG-11-dUTP或生物-11或16-dUTP（图1）。也可以加入一个碱基类似物，如LNA（见图2）。

图1 | 常用的标记核苷酸以及地高辛-11-dUTP和生物素-16-UTP的结构式

这些标签通过间隔物分子与尿嘧啶的5′原子共价连接。数字11和16表示两个分子之间间隔物的长度。间隔物使标签与杂交探针有足够的距离，以避免在后续步骤（标签的可视化）中出现立体阻碍。这两种标签都可以用特定的抗体进行检测。生物素也可以用链霉菌素检测。虚线表示尿嘧啶分子上可能产生氢键的地方。除了地高辛和生物素外，荧光色素也可以与核苷酸偶联。

图2 | 锁定的核酸（LNA）

碱基类似物在核糖的O-2′和C-4′原子之间提供一个甲基键。LNA核苷酸被纳入DNA中。

来源于生物合成（重新设计的）。

a DNA、RNA和LNA的单体的化学结构。

b 当一个核苷酸被LNA或PNA取代时，Tm增加。

c 在替换了3个或9个碱基的DNA寡核苷酸后，Tm增加。增加的程度取决于核苷酸的性质。A、C、G或T

水解探针（在qPCR中）配备了两个荧光色素，而且经常还配备一个MGB（见图3.3和图4）。为了避免H-键堆叠和其他非共价相互作用对探针-靶点结合的干扰，同时也为了让报告基团进行检测，标签与寡核苷酸通过间隔物进行物理隔离（见图4）。

图3 | 小沟结合（MGB）

（a） MGB是一种二氢环吡咯三肽，对DNA分子的小沟有特殊的亲和力。它增强了引物或探针的杂交能力。这样，只使用了普通数量的核苷酸的一半（见图4a）。

（b）中概述了传统探针和MGB探针的杂交和随后的融化过程。靶点的大小是27bp，5′端第5位有错配（绿色野生型，蓝色T/C错配）。很明显，与传统探针相比，短的MGB探针具有更高的区分突变异和野生型的能力（关于MGB探针的细节，见图4）。

图4 | 用水解探针猝灭

一旦带有分离核苷酸的荧光标签在自由溶液中释放，就会开始发出荧光。猝灭剂也处于隔离状态，但与荧光色素的距离太大，无法猝灭荧光

（a）5′-氟色素（F）、MGB（三肽）、猝灭剂（Q）和间隔物的分子组织都在寡聚物的3′端。图3.23b中概述了连接体。

（b）连接在连接体上的荧光色素（F）的分子组织，通过在寡核苷酸的5′端加入胞嘧啶-dUTP。

c 实时PCR中5′-核酸酶活性的原理。靶点变性后，引物和水解探针都会与其中一条DNA链杂交。探针的设计方式是使其比引物更快速有效地杂交。探针必须对扩增物有很高的特异性。探针的位置在靶点的5′端附近。水解探针在溶液中，由于附着在探针上的非荧光猝灭剂（Q）的猝灭作用，不会自动发亮。一旦寡核苷酸与靶点序列完全退火，DNA的合成就从引物（和探针）的3′端开始。当酶遇到水解探针时，聚合酶的5′-3′-外切酶域将变得活跃，并逐个碱基地去除探针。在这个过程中，DNA的合成继续进行。水解探针用于实时PCR。

单一性、合成效率和杂交能力之间的平衡对于15 ~ 20个核苷酸大小的寡核苷酸来说是最理想的。大于25个核苷酸的寡核苷酸会导至正确的寡核苷酸和那些缺少核苷酸的寡核苷酸之间的平衡下降，变得不利。这就解释了为什么在原位探针杂交中，使用大约20个碱基的多个寡核苷酸而不是1个大片段。

寡聚糖在实时PCR和传统的杂交测定中更经常被用作探针。寡核苷酸的优点是保质期长（如果冻干保存或在-20℃下保存可达数年），由于有明确的碱基顺序，重现性高，纯度高，成本低，可用于有义或反义序列，在组织或细胞中扩散快。

寡核苷酸可以从专业的公司购买到所需的浓度和数量，无论是否有标签，是否经过修饰，以及是否有首选的纯度（HPLC或凝胶电泳，丢弃不完整的产品，等等）。这些寡核苷酸是以冻干的形式提供的。为了保证质量和减少污染的风险，建议将原液稀释成工作溶液，等分并在-20℃或-80℃下无污染保存。

PCR用于在体外合成大量的特定双链DNA片段，以用作双链或单链探针。PCR探针可以在PCR过程中通过加入标记的DNA核苷酸或标记的引物进行标记（图5）。或者，标签可以在PCR后使用切口平移或随机引物加入。

图5 | PCR反应中的探针标记

PCR产物可用作探针，可在PCR反应过程中使用标记引物（a）或标记dNTPs（b）（如DIG-dUTP或生物素-dUTP；图3.5）进行标记。探针将用制备电泳法进行纯化。末端标记程序也适用于纯化的扩增物

重组DNA技术被用来开发能够与大于150个核苷酸的靶点杂交的探针，以及在其他探针或混合探针不是首选方法的情况下使用。

使用特定的载体，通常是质粒或DNA噬菌体，将所需的探针作为DNA片段插入其中。这些构建体被转移到合格的细菌菌株中，可以在细菌培养过程中大量繁殖。之后，可以用分子生物学技术从载体的DNA中收获双链DNA片段。许多载体和相应的宿主在市场上可以买到，是一种试剂盒。利用DNA重组技术已经构建了可在细菌（BAC）或酵母（YAC）中繁殖的人工染色体。

可以使用特殊的重组质粒制备具有所需极性（有义或反义）的单链RNA或核糖探针。从DNA依赖性RNA聚合酶的启动子（从噬菌体SP6到T7），DNA依赖性RNA聚合酶将合成单链RNA探针。这种技术只在寡核苷酸和/或PCR探针不合适时使用。