cfDNA检测或可替代侵入性骨髓检查-- 同时检测白血病状态和微生物动态的方法

无细胞DNA（cfDNA）测序有望成为一种非侵入性诊断工具，用于评估母婴健康、早期检测癌症和监测治疗反应，以及以识别感染性微生物。急性淋巴母细胞白血病（ALL）是最常见的儿童癌症，尽管在过去50年中预后有显著改善，但仍然是儿童癌症相关发病率和死亡率的主要原因之一。此外，由于当前细胞毒性疗法的免疫抑制和骨髓抑制后果，感染性并发症仍然是治疗相关死亡率的主要原因。

几十年来，血浆中cfDNA的存在已为人们所知。根据DNA测序技术的进展，循环肿瘤DNA（ctDNA）目前正在被评估为恶性肿瘤症状前检测的生物标记物，以及监测反应和指导治疗的工具。迄今为止，大多数研究都是在实体瘤上进行的，其中ctDNA监测越来越显示出诊断和预后价值，有可能改善癌症患者的预后。无细胞RNA测序和核小体印迹显示，造血细胞是健康个体循环核酸库的最大来源，这表明与实体肿瘤相比，ctDNA监测在检测造血源性肿瘤方面可能更为敏感。

血浆中非人类DNA的鉴定和定量也显示出作为诊断传染病和监测人类病毒组的策略的前景。研究表明，微生物cfDNA（mcfDNA）测序能够更快速地检测稀有物种以及通过常规细胞培养方法难以检测的病原体。例如，最近发现，鸟枪式mcfDNA测序可以预测患有癌症的儿童患者即将发生的感染。mcfDNA测序敏感性的提高可以进一步确立微生物测序在诊断和预测感染性并发症方面的临床实用性。提高mcfDNA检测灵敏度的一种策略是丰富微生物特异性序列。

近日，一个以斯坦福为主的团队在 Science advances 杂志上发表了一篇题为“Simultaneous monitoring of disease and microbe dynamics through plasma DNA sequencing in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia”的文章。在本研究中，研究团队试图开发一种方法，同时监测ALL患儿的两个主要死亡原因：（i）疾病持续或复发；（ii）免疫抑制环境中的感染性微生物。为了实现这一点，研究团队开发并评估了一种新的基于捕获的超深测序策略，该策略在接受诱导化疗的ALL患者的血浆中富集了白血病特异性突变和潜在微生物。结果显示，这种方法可以检测和监测大多数患者的白血病，并确定在患者接受治疗时特定的ctDNA动态模式。此外，通过比较细胞与ctDNA变异等位基因组分（VAF），研究团队发现在诊断时进行侵入性骨髓检查以分离恶性细胞对于分析小的基因组变异可能是不必要的，因为在两种样本类型中检测到相似的变异频率相当。

图片来源：Science  Advances

在临床试验中，共有168份样本接受了测序，这些样本是从20名新诊断ALL患者中前瞻性收集的，他们接受了为期6周的诱导治疗。从外周血（PB）和骨髓中收集细胞和血浆（无细胞）组分，以便比较白血病相关突变和感染性微生物DNA的不同潜在储存库（图A）。panel覆盖率（图B）在目标序列上是均匀的，在12884次读取的平均深度上覆盖了100%的目标区域。

诊断时，平均血浆cfDNA产量与非细胞骨髓（NCBM）cfDNA产量相似（平均值分别为85 ng和75 ng）。在诱导化疗的前几天，血浆cfDNA产量增加，可能是由于开始治疗后白血病细胞迅速死亡所致。NCBM cfDNA产量在第15天达到峰值，这表明骨髓中的细胞仍然以比PB中的白血病细胞更高的速度和更晚的时间点死亡。此后，在整个诱导治疗过程中，cfDNA浓度保持在10 ng/ml左右，而在诱导治疗后期，NCBM cfDNA产量增加（图C），这可能反映了诱导治疗后再生造血细胞的更新。

工作流程、质量控制指标和cfDNA产量。

图片来源：Science  Advances

在20名患者中，有17名患者（85%）在诊断时，ctDNA NGS识别出一种或多种变体（图A）。诱导化疗过程中的突变清除几乎是普遍观察到的。每个患者平均有2.3个可检测的突变（范围为0到5；标准差为1.3）。检测到39个独特突变，只有一个共享突变实例（病例3和16中的KRAS p.G13D）。当患者接受诱导化疗治疗时，观察到不同的变异等位基因清除模式。一般来说，在整个诱导治疗过程中，VAF都会先增加后减少（图B），这与化疗药物的药代动力学和细胞快速死亡一致。在这段时间内，这些基因座的覆盖率保持不变。16例患者中有8例（71%）发现的躯干突变（truncal mutations；定义为NCBM和PB中等位基因频率均大于0.25），包括NOTCH1、NRAS、KRAS、JAK2、NF1和ADGRL2基因。

患者队列中纵向清除率的变异。

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研究团队建立了同时检测细胞和cfDNA中病毒、细菌和真菌微生物物种的技术可行性。五名健康对照组和五名诊断为急性髓细胞白血病（AML）的患者的mcfDNA作为对照组。

结果显示，研究团队发现mcfDNA的变化是动态的（图B）。与健康对照样品相比，ALL患者中检测到的主要微生物种类发生了变化。例如，在所有健康样本中都检测到了Ralstonia菌属，但在126份ALL样本中仅一例检测到此菌属。相反，在大多数样本中均检测到Cutibacterium，但在健康对照组中均未检测到表皮细菌，这可能代表共生皮肤细菌入侵人类宿主的能力。在一部分患者中检测到已知的导至ALL患儿死亡的芽孢杆菌Bacillus。对于真菌DNA，60%的健康对照组和17个诊断性所有样本中的13个（82%）检测到Malassezia，但AML样本均未检测到。

诱导期内细胞骨髓、NCBM和PB中的微生物（病毒、细菌和真菌）丰度。图片来源：Science  Advances

PB诱导治疗期间病毒种类检测的趋势表明，每个病例检测到的病毒种类具有可重复性（图A），并与健康对照组和五个年龄匹配的AML病例进行比较。所有健康对照样品中均检测到一种病毒，即人类疱疹病毒6型（HHV6B），而在所有诊断样品中，只有1/17（16%）检测到HHV6B。17份诊断样本中有9份（53%）在诊断时至少检测到一种病毒。在9名诊断时检测到病毒物种的患者中，有9名患者在至少一个后续样本中检测到相同物种，9名患者中有8名患者在诱导治疗期间检测到其他病毒物种，8名诊断时未检测到病毒物种的患者中有6名患者随后检测到DNA病毒。这些结果表明，在诊断时存在病毒感染和再激活，但随着患者接受伴随免疫抑制的化疗，相对物种组成会随时间发生变化。

诱导治疗期间PB病毒种类检测。

图片来源：Science  Advances

研究团队在患者中发现了几种一致的微生物库模式。首先，真菌和病毒序列往往在骨髓和PB血浆中一同被发现，而细菌往往是采样区特异性的（图B）。这种模式在第1天和第15天会之间发生变化，PB在第1天会检测出更多物种，而在第15天，这两个采样标本结果通常是一致的（图C）。这表明，在诊断时，微生物位于骨髓取样点以外的位置，但仍在PB中检测到，并且mcfDNA在第15天随着免疫抑制增加变得更加广泛。除病例10外，所有17名患者在检测临床适应症时，病毒和细菌结果均为阴性。这表明cfDNA微生物检测灵敏度高于当前微生物诊断的临床检测。

不同采样区真菌、病毒和细菌物种的一致性研究。

图片来源：Science  Advances

急性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗需要对免疫抑制环境中出现的白血病疾病负担和感染进行持续的风险评估。本研究旨在评估杂交捕获下一代测序panel的可行性，以测量20名接受全程化疗的儿童患者的白血病疾病清除率和微生物物种丰度。研究团队已经证明，定制的ctDNA捕获策略可以无创地测量ALL儿童患者的两个主要死亡原因：白血病疾病负担和感染性微生物入侵。这一概念证明有助于建立一个技术和概念框架，该框架将扩展并应用于其他白血病患者，以及其他癌症类型。分子监测有助于加速深入了解宿主-微生物-白血病相互作用的时间生物学，包括这些变化如何与抗癌治疗疗效相关并改变其疗效。

但该研究有几个重要的局限性。首先，研究团队没有同时检测拷贝数和融合。其次，微生物方法专注于已知物种。此外，微生物鉴定并不能确定对所选抗菌剂的敏感性。

尽管有局限性，此方法仍然比基于外显子组的方法更具成本效益。还需要进一步的工作来检测来自ctDNA或循环肿瘤RNA的基因融合和拷贝数变体，以及临床使用的标准化和验证，以开发无创的全球基因组检测，来减少侵袭性骨髓活检。