与组织活检和单个循环肿瘤细胞（CTCs）相比，循环肿瘤细胞簇（CTM）可能成为反映肿瘤 ...

20世纪90年代末、2000年初，在结肠癌\前列腺癌患者的血液中发现了肿瘤细胞簇。但目前CTC捕获方法对CTC团簇的捕获效率较低，可能低估了CTC团簇的实际数量。CTC簇在癌症侵袭性中的意义不应被忽视，而且它们甚至可能代表了一种有价值的靶向治疗途径。

循环肿瘤细胞(CTC)簇的起源和传播

细胞团簇从原发肿瘤部位分离，通过细胞间相互作用产生同型单克隆或多克隆肿瘤簇；也可以与瘤浸润的基质细胞或免疫细胞相互作用，形成异型簇；血管中也与循环免疫细胞或血小板有形成异型簇。CTC簇的内渗可通过侵袭性细胞和巨噬细胞导联或通过肿瘤微环境中常见的血管渗漏发生。在血液中，CTC团簇通过抗缺氧、抗剪应力和免疫逃逸来增强生存，并增强其干细胞性质导至转移潜能增强，在具有良好微环境条件的组织中外渗后形成单克隆或多克隆转移。

CTC簇的分子特征初步探究

1、核心机械粘附蛋白

初步研究了CTC团簇与单个CTCs的分子谱。CTC簇表达细胞-细胞粘附蛋白，包括参与紧密连接和桥粒的蛋白。单细胞分析发现，与乳腺癌的单个CTCs相比，由连接蛋白JUP基因编码的桥粒蛋白在CTC簇中过表达219倍。在转移性乳腺癌的小鼠模型中，shRNA下调触球蛋白导至CTC团簇形成的急剧减少，而单个CTC数不受影响。同样，在转移性乳腺癌的体外或体内模型中发现了plakoglobin的过度表达，其下调破坏了CTC团簇。在临床水平上，CTC簇中的触珠蛋白表达是乳腺癌患者的独立预后因素，糖蛋白 CD44 可能参与 CTC聚集，需要进一步验证。

2、干细胞特性

一些研究一致认为CTC聚集赋予细胞干细胞性质，特别是CD44，一种在癌症干细胞(CSC)中经常上调的细胞表面标记物，在CTC簇中过表达，CD44参与多种肿瘤细胞的干细胞信号的维持。在乳腺癌PDX衍生和患者分离的CTC簇中发现干细胞相关基因上调。同样，来自结直肠肿瘤的器官释放过表达CD44的CTC簇。ctc的聚集可能为CSCs提供了一个良好的维持生态位和它们前往远处转移部位所需的保护，这与CTC 簇中发现的转移微环境模型基因的高表达是一致的。由于CSCs被认为是转移传播的主要参与者，它们在CTC簇中的行为解释了转移性疾病与CTC 簇之间的联系。

3、生存优势

在CTC簇中维持细胞-细胞粘附可能会对细胞凋亡产生抗性，与乳腺癌来源的单个CTCs相比，CTC簇中发现抗凋亡Bcl2蛋白过度表达。同样，通过乳腺癌 PDXs产生的CTC簇RNAseq 谱分析，发现整个凋亡途径被下调。从PDX和患者样本中获得的CTC簇中报告了与细胞增殖相关的基因组的富集。同样，与单一的CTCs相比，CTC簇中KI67阳性细胞的百分比也有所增加。CTC簇抵抗生理血流引起的剪应力是至关重要的。因此，凋亡抗性和增殖增加、剪切力抵抗的结合可以解释CTC簇的生存优势。

4、免疫系统逃逸

CTC具有逃避免疫系统的显著能力。在血液循环和转移部位CTC的免疫逃逸涉及多种机制。例如，CTC中免疫检查点蛋白表达增强或抗原呈递过程受损。CTC簇与单个CTCs相比，参与免疫应答的多种通路，如II型干扰素和TNF信号通路或抗原加工和呈递均被下调，这表明它们更具耐药性。CTC簇同样观察到MHCII和T细胞活化基因的下调。免疫抑制剂CD24在结直肠癌来源的CTC簇中被观察到较高的表达。

临床中的CTC团簇

与单一CTC不同，CTC团簇检测尚未从其临床相关性的角度进行深入的研究。这可能部分是由于CTC检测方法会破坏团簇并限制它们的检测。绝大多数研究显示CTC簇在实体癌症检出率是16%-75%（表 1）。更多的团簇与较短的PFS相关，强调了团簇与转移性疾病的联系。包括我们在内的一些研究报道，CTC簇（≥1簇）的存在不利于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌患者的生存，虽然在分析时没有转移性疾病的迹象。基线和化疗期间从血液样本中分离的CTC进行培养，发现CTC簇表型与治疗反应和总生存期之间存在相关性。研究表明，现在是时候从CTC单细胞检测过渡到CTC团簇检测，作为一个具有确定临床价值的独特指标。

改进常规CTC团簇检测

    文献检索表明，当在液体活检中计数CTC时，并没有系统地进行CTC团簇识别。现有检测CTC的方法可能会破坏CTC团簇。特别是，在终点有可见细胞的方法比基于CTC富集和一次性分子鉴定的方法更相关。因此，精确医学可能受益于CTC团簇内的单个细胞研究，因为越来越多的证据支持它们反映肿瘤异质性的能力。

安泰康生物2.5D柔性高密度微孔阵列膜微流场超滤系统（微流控+阵列膜）同步捕获不同大小、形状和组成循环肿瘤相关稀有单细胞、完整细胞簇（LCTRC\LCTRC簇）

CTC团簇的未来发展

CTC团簇增强了CTC特性，特别是转移潜能和干性。CTC簇内的单细胞分析可以检验肿瘤细胞迁移是否与普遍接受的遗传差异增强作用一样，可能是转移特性和肿瘤侵袭性的决定因素。同型和异型CTC簇均从上皮来源的实体肿瘤中得到证实，最近在70例转移性乳腺癌患者中得到了验证证(CTC簇：8.6%，CTC-白细胞簇：3.4%)。CTC团簇在血癌方面很少有报道。然而，在淋巴瘤模型中，与基质细胞相关的CTC的异型簇比同型的更常见。探索同型CTC团簇和包含与白细胞或血小板相关的独特的异型CTC团簇之间是否存在功能差异/抗性是非常有意义的。血小板被认为具有抵抗细胞死亡、EMT促进、免疫系统逃逸和外渗的能力，因此，它们与CTC的关联促进了其转移潜能。但血小板与CTC簇的关联很少被报道为，可能是因为血小板覆盖的循环肿瘤细胞(CTC)表面表位的掩盖或下调而极其难以分离。未来的研究应着眼于探索簇中CTC和血小板之间的相互作用，因为CTC簇已被证明过表达血小板活化通路。

近年来，已经开发出了同时适用于单一CTC和CTCCTC团簇的多个检测平台。根据其物理性质（大小）特异性地分离CTC簇，包括异型CTC团簇，而不需要进行任何标记，并保留其完整性。未来的发展应该着眼于允许同时进行表型、分子甚至功能分析的方法。

现在已经很好地证实了肿瘤内异质性对治疗的反应影响。原发肿瘤的可及性通常具有挑战性和侵袭性。单个CTC可以揭示肿瘤的多样性和治疗耐药性。CTC簇是否携带原发性肿瘤的异质性值得深入分析，特别是考虑到最近的研究显示CTC簇的寡克隆性质。这与研究肿瘤模型发现CTC簇更有可能包含药物抗性突变的事实是一致的，CTC团簇使得有更多的机会来识别突变和获得个性化药物。

与组织活检和单一CTC相比，CTC簇可能成为反映肿瘤行为的更可靠的工具。在患者管理过程中，CTC团簇计数可能提供更多关于患者预后的无创信息，并可能是转移性疾病评估的良好辅助生物标志物。进一步对CTC簇内细胞进行个体表征将有助于测量肿瘤内异质性和药物敏感性/耐药性。CTCCTC团簇与治疗耐药性之间的联系越来越明显。Lee等人报道了原发性或复发性卵巢癌的铂耐药性与外周血中存在CTC簇的相关性，该研究强调了CTC团簇和转移进化之间的相关性。此外，当暴露于阿霉素时，CTC团簇的耐药性导至比单个CTC更高的生存能力。CTC团簇可以是耐药性的预测因子，也可以是行动者。CTC团簇与干细胞特性、转移和治疗耐药性的关联表明了现在针对癌症进展和/或复发的关键靶治疗不足。同样，CTC簇与不良疾病预后之间的联系表明，抑制CTC簇的形成和释放可以减少癌症的传播。特别是通过细胞分离清除它们可能有助于杀死耐药性和传播CTC团簇。另一种有前途的治疗方法将破坏运输过程中的CTC团簇。

总之，需要做更多的工作来研究CTC团簇形成、生存、耐药、转移能力及其与临床的相关性，并将它们视为有希望的治疗靶点。值得注意的是，它们已经可以为临床医生的诊断和预后提供了有益的信息。