诊断技术｜细菌、古细菌和病毒的DNA

在上一篇文章当中，我们对分子诊断进行了初步的介绍，从这篇文章开始，我们将会对分子诊断进行深入研究。

无论是那种诊断工具，首先都应该对自己的目标物，也被成为Biomarker，有着明确的认识，那么，我们就从biomarker的介绍开始。

核酸，特别是其氮碱基的序列，是分子诊断中最重要的目标，除了单链DNA和单/双链RNA病毒外，所有生物体都含有双链DNA作为遗传信息的载体。

在真核生物（有细胞核的细胞）中，基因组DNA的数量超过了原核生物（细菌和古细菌）和病毒的数量。病毒具有最小的基因组（有时不超过3kbp），这意味着复制等主要过程被委托给宿主细胞。

令人吃惊的是，在脊椎动物（如人类和无脊椎动物）与昆虫（图1）之间的基因组大小没有大的差别。在变形虫中发现的最大基因组由670×109 bp组成，而细菌的基因组要小得多，由几百万个碱基对组成。

基因组的大小具有惊人的多样性，最有趣的是，任何特定生物体的碱基对数量与它在进化阶梯上的位置之间没有关联。基因组的绝对大小（一条或多条染色体上不同碱基对的数量）和倍性程度（一条染色体在一个细胞核中出现的次数）（图1）对基因组大小贡献更大。

图1|与倍性相关的基因组C值*；单倍体（1N）基因组的DNA重量（pg）**。

C值提供了一个生物体在一定DNA重量下的基因组拷贝数（1pg=978Mb）的信息。这可能与系数106不同。有些类别的生物体没有二倍体基因组，而是它的一个倍数，23，24~210。许多植物栽培品种是三倍体（23），甚至更高（24，25）。与染色体拷贝数一起，DNA的绝对重量会有所不同，即使染色体数目和大小（碱基数）是相同的。很明显，在真核生物内部，存在着很高的C值变化。在计算具有一定重量的分离物的基因组拷贝数时，必须考虑到C值。

通过研究核苷酸序列，可以识别每一个生物体，基因组信息可能在不同层面上是独特的，这会涉及到一个独特的序列，为某一物种的个体所特有，或存在于该特定物种的一个亚型或一个品系中的共同序列。

但它也可以适用于一组相关的物种，甚至适用于进化阶梯中更高层次的共同序列。核酸序列的这种独特性被用于杂交技术的检测和对比度生成分子的可视化。杂交技术用于PCR，在细胞和组织切片或微阵列中使用，并经常参与其他技术。通过测序，可以确定DNA（一个片段）的整个核苷酸序列。

原核生物和真核生物领域的划分可以追溯到1937年，这种划分是以有无细胞核为依据的。

原核生物缺乏细胞核，其遗传物质在细胞质中自由漂浮。古代生物最初被归类为原核生物，因为它们在形态上有相似之处，如没有细胞核，然而，各种过程中的一些基本差异导至它们在1990年被Woes划分为一个独立的领域，命名为古细菌。特别是它们的转录和翻译与真核生物的关系比与原核生物的关系更密切，它们的核糖体（组蛋白/DNA复合物）和对抗生素的敏感性也有区别。

此外，它们有独特的酶系统，使它们能够作为嗜极生物生活。它们甚至可以在最极端的环境条件下生长，如高压、高温或高盐。其中，热稳定的水生热力菌被证明对PCR技术的发展至关重要，其（Taq）DNA聚合酶。

细菌的DNA。到目前为止，大多数细菌在其细胞质中有两种类型的环状双链DNA分子（图2）。一种是大的，以单数存在，被视为「染色体」。另一种环状形式，称为质粒，较小，可出现相当数量（每个细菌20~40个拷贝）。

这些染色体外的质粒编码与抗生素抗性有关的基因，因此是分子诊断的重要目标。

*百分之一的细菌物种没有环状染色体，但有一条线性染色体，可以存在于多人中。伯克霍尔德菌属含有三条线性染色体。

图2|细菌DNA

细菌细胞中可存在两种类型的DNA。染色体几乎总是一个圆形分子，由（平均）60-500万bp*组成。此外，还可能出现小的圆形DNA分子，即所谓的质粒。这些分子的大小可能从几千到几十万个核苷酸不等，这取决于细菌种类和质粒的类型

细菌DNA主要由「单拷贝」基因组成，其中大部分基因在一个启动子的调控下组织成功能组。编码各种蛋白质的各种mRNAs与它们的操作子一起被转录成一串，但需要注意的是，它们在转录后和翻译前变得不相连。

基因组上有各种短的重复序列（BOX重复，REP或ERIC），这些序列可以检测不同菌株之间的遗传差异。原核生物的DNA还含有真核生物DNA中出现的几个直接重复序列。尽管细菌基因中的内含子序列已被描述，但这些内含子序列的数量比真核生物中的少得多。

古代生物有一个圆形的双链DNA，其大小与细菌的「染色体」相当。一些物种还含有一个或多个质粒。

病毒不能独立复制。在这个意义上，它们不被认为是原核生物。它们依赖于被病毒感染的原核生物或真核生物宿主。噬菌体是一组独特的病毒，专门针对细菌和古细菌。

一个被称为帽状体的蛋白衣包裹着病毒基因组。某些病毒有一个由宿主细胞的细胞膜组成的包膜，该包膜被病毒改变。某些病毒可以作为真核生物染色体中宿主DNA的一个组成部分而长时间地休息。

不仅在病毒基因组的大小、组成和复杂性方面，而且在宿主特异性、复制策略等方面，都可以发现相当大的差异。一些病毒既可以以外显形式存在，也可以以整合形式存在于宿主细胞染色体DNA中。

外显体病毒可以在细胞质（主要是RNA病毒）或细胞核（主要是DNA病毒）中发现。

病毒基因组可以根据不同的特征进行区分：DNA或RNA，组织（单链或双链）和大小。编码能力可以从只有3个到超过200个蛋白质不等。

病毒使用自己的DNA或RNA聚合酶进行基因组复制。后者对于RNA病毒来说是独一无二的：它们逆转了遗传信息的流动，正如生物学的核心教条所定义的那样，它们利用逆转录酶（一种RNA依赖的DNA聚合酶）将RNA重塑为DNA。

某些DNA病毒（如人类乳头瘤病毒或HPV的基因型）已知具有转化特性，可导至其宿主发展或恶性肿瘤。与此过程有关的细胞转化过程的机制有很大不同。

病毒是根据其遗传物质分类的（所谓的巴尔的摩分类法，图3）。第一类病毒含有双链DNA，在细胞质中进行复制。

第二类病毒含有单链DNA，感染后，会合成一个互补的毒株。到目前为止，我们只知道有一个家族属于这个类别，即副病毒科。

第三类和第四类分别含有双链RNA和阳性单链RNA。第五类病毒含有阴性单链RNA，利用病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶转录成mRNA，这条链不具有感染性。

第四类包含逆转录病毒，如HIV，在感染逆转录酶后，从阳性单链RNA形成双链DNA。

图3|病毒的分类

根据巴尔的摩分类法，病毒可分为六个不同的主要类别。双链或单链、正负向分子决定了这一类别，同时复制策略和表达模式也是重要的决定因素

这类酶在现代分子生物学中被用来将RNA转录成cDNA。