PCR核酸检测操作注意事项

本文为大家讲解《PCR实验室新冠核酸检测操作注意事项》，重点从新冠病毒生理特性、荧光PCR原理、PCR实验室筹备规范、样本检测环节操作、实验室数据分析、常见问题解析等几个方面讨论学习。

PCR实验原理

重复进行“变性 - 退火 - 延伸” 三个过程，模板DNA的量就会呈指数倍增加，理论上讲经过  n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。

常见问题解析

1、新冠试剂出现翘尾，怎么处理？

答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样。

如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核。

一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。

如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。

2、N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高？是否会和其他冠状病毒片段重叠？

答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。设计时候，两个基因的序列不一样，导至灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。

3、新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？

答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。

4、采用生理盐水做阴性对照，内标也会增长，怎么解释？

答：因为试剂采用的是内源性内标，内源性内标是用人源基因标记，此基因存在于人的表皮细胞内，操作过程中就可能会出现人源性的污染，另外环境污染也有可能导至内标增长，这也是前面提到的建议做环境样本质控。

5、新冠样本内标不出如何处理？

答：如果新冠样本内标不出，该样本必须复查，可重新混匀该样本提取核酸，如果重新提取该样本内标还是不出，在排除提取问题的情况下，说明采样不合格，要通知临床重新采样复查。

6、采集环境样本检测新冠状病毒，为啥大部分样本内标不出，偶尔个别样本检测出内标？

答：因为新冠试剂检测的是人内源性内标，环境样本一般不含有人源细胞，所以检测不出内标；偶尔检出内标，可能该环境样本上有人源性细胞粘附，故而检出内标。