洞察｜DNA甲基化，疾病和相关检测技术

DNA甲基化是人类最早发现的表观遗传修饰之一。它涉及将甲基（CH3）基团转移到构成脱氧核糖核酸（DNA）的胞嘧啶碱基的C5位置，以产生5-甲基胞嘧啶（5mC），该反应由一个称为DNA甲基转移酶（DNMTs）的酶家族催化。

通常情况下，改变的胞嘧啶碱基紧邻鸟嘌呤碱基。这导至两个5mC碱基在互补的DNA链上相互对角而坐。

DNMTs有几种不同的作用，例如，它们可以作为de novo DNMTs发挥作用，包括在DNA分子上建立最初的甲基模式。而其他DNMTs则采用维护作用，在复制发生后将甲基化模式从现有的DNA链复制到新的伙伴上。

20世纪80年代的几项研究显示，DNA甲基化在基因调控和细胞分化中都发挥着重要作用。从那时起，进一步的研究证实了异常甲基化在各种疾病的发展和进展中的作用。

DNA甲基化是特定组织表达的主要控制器之一，它允许一个基因在正确的器官或细胞类型中正确表达。DNA甲基化作为一种缓冲，可以稳定我们的基因组并使重复的染色体区域沉默。许多疾病显示出DNA甲基化的改变，破坏了细胞活动。

在哺乳动物中，甲基化大多是稀疏的，但在特定的CpG或CG（胞嘧啶-鸟嘌呤）序列中大量分布。在基因组的某些区域，CpG被大量发现（如CpG岛）。

在健康的细胞中，与基因启动子相关的CpG岛通常没有甲基化，而在基因体内发现的岛在发育过程中往往会变得甲基化。研究人员指出，启动子区域的CpG岛的甲基化可导至特定基因的不适当的下调（例如，在癌细胞中沉默肿瘤抑制基因）。

DNA甲基化的作用和地位在不同的生物王国中是不同的。如上所述，哺乳动物往往拥有相当全面的CpG甲基化分布，而无脊椎动物则通常表现为甲基化的“镶嵌”模式。

DNA甲基化在许多生物过程中起着重要作用，例如，基因组印记、干细胞分化和染色体稳定性，并被认为是调节细胞生长和增殖的基本修饰。

DNA甲基化模式是可变异和可遗传的，在亲代等位基因的DNA甲基化异常的情况下，可能会发生各种严重的疾病，如癌症、衰老障碍、代谢性疾病、心理障碍和遗传性疾病。

科学家在研究基因组印记时首次发现了DNA甲基化在人类疾病中的作用。

基因组印记是一种稳定和可遗传的现象，独立于经典的孟德尔过程而发生。它涉及到基因的表观遗传标记（如甲基化），基于其父母的起源，导至基因的不同表达，而不修改基本的DNA序列。这里我们强调一些由异常DNA甲基化引起的疾病。

2.1、自身免疫性疾病

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性炎症疾病，引起大小关节的对称性多关节炎。科学家们对外周血单核细胞进行了全基因组DNA甲基化分析，发现人类白细胞抗原（HLA）II类的DNA甲基化发生改变。这种异常的DNA甲基化可以促进患RA的遗传风险。

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，身体的免疫系统会错误地攻击自身的健康组织。一项全基因组的DNA甲基化评估显示，系统性红斑狼疮患者的基因中有不同的DNA甲基化，与自身抗体的产生有关。在IL-6基因的启动子区域观察到异常的DNA甲基化。

2.2、代谢紊乱

科学家们还将高血糖和高脂血症等情况与不同的DNA甲基化联系起来，这导至了基因表达的异常。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A和磷酸二酯酶7B启动子的甲基化降低显示了人类葡萄糖刺激的胰岛素分泌失调。

DNA甲基化也与肥胖有关，在脂肪组织和血细胞中低氧诱导因子3α的DNA甲基化增加导至身体质量指数（BMI）的增加。

2.3、癌症

甲基化是许多癌症类型中最早的变化之一，检测无细胞DNA中的甲基化状态是一种有希望的非侵入性早期癌症检测途径。最近，omics（基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学）研究为这些发现提供了佐证，证实异常的DNA甲基化与肝细胞癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞肺癌、白血病和甲状腺癌有关。

癌症患者普遍存在DNMTs表达水平的差异和DNMTs的突变，这两者都会影响甲基化机制。以前的研究表明，表观遗传失调在肿瘤的发展和转移中起着关键作用。

在癌症中，研究人员观察到基因组普遍的DNA低甲基化和更多的局域性DNA低甲基化，这影响到经常在启动子发现的富含CpG的序列（所谓的CpG岛）。癌症中的大多数DNA超甲基化事件是无足轻重的，因为基因已经沉默了。

然而，一些甲基化事件可被视为肿瘤驱动因素，例如，当它们使编码抗增殖因子的基因、DNA修复基因或对正常细胞分化至关重要的基因沉默时。

甲基化模式是非常异质性的。它们可能从一种癌症类型到另一种，也从一种细胞类型到另一种细胞类型而有所不同。了解这些修饰的作用及其在不同癌症类型中的影响，对于针对潜在的治疗和疗法至关重要。

识别癌症特异性DNA甲基化标记（在一种或多种癌症类型或亚型中特异性甲基化或不甲基化的基因组区域），可用于检测和监测癌症，以期制定治疗策略。

胶质瘤是一种常见的脑癌类型，它起源于支持大脑神经元的胶质细胞。

最近，研究人员使用了一种单细胞多组学方法来确定从胶质瘤患者那里获得的单个肿瘤细胞内的甲基化标记。他们能够确认负责将细胞从一种状态转移到另一种状态（例如，干细胞样状态到成熟状态）的DNA甲基化的不同模式，并从取样的肿瘤中开发出细胞状态图。

从该研究中获得的见解可能有助于开发更好的方法来检测、分期、监测和治疗该疾病。

2.4、神经系统疾病

异常的DNA甲基化也与神经系统疾病有关。在雷特综合症和自闭症谱系障碍患者中发现了甲基CpG结合蛋白2基因的突变。科学家们发现，DNA甲基化状况的变化促进了与突触活动相关的基因表达的改变。

在精神分裂症患者中观察到周边血液中儿茶酚-O-甲基转移酶的甲基化水平降低。

一项全表观基因组关联研究比较了三个不同哺乳动物物种组织的甲基化模式，以确定亨廷顿病是否伴随着DNA甲基化的改变。研究人员发现，该疾病与DNA甲基化水平的“深刻变化”有关。

对阿尔茨海默病的DNA甲基化进行的系统审查发现，编码一种称为淀粉样前体蛋白的蛋白质，与淀粉样斑块的形成有关APP基因，在大脑和外周血中持续高甲基化。

大多数分析DNA甲基化模式的常规方法都是基于使用高温和高浓度亚硫酸氢钠通过化学脱氨将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而一些较新的方法则使用酶进行脱氨。

通常情况下，病理学家在预测癌症的生物标志物和从肺癌患者获得的小型活检组织样本或液体样本中代表肿瘤块的整体状态方面面临困难。在这种情况下，这些新的酶学方法可以让研究人员处理非常少量的DNA（活检样本）。

除了传统的方法之外，测序和阵列技术的最新进展使研究人员能够进行详细的DNA甲基化分析，为其在疾病中的作用提供一个全面的图像。用于研究DNA甲基化的最新方法是通过长读测序，这些技术允许读取更长的序列（>10000 bp）。

最广泛用于以成本效益的方式研究人类DNA甲基化的技术是基于DNA甲基化微阵列，因为它能够对基因组的850K CpG位点都进行检测。

下面将更详细地讨论用于确定DNA甲基化的一些技术。

3.1、基于双硫酸盐的检测

双硫酸盐处理是一种常用的方法，由Frommer等人（1992）介绍，用于分析5mC和非甲基化碱基。

在这种方法中，基因组DNA暴露在亚硫酸钠中，亚硫酸钠促进非甲基化的胞嘧啶脱氨并将其转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。最后，随后的PCR扩增将尿嘧啶转换为胸腺嘧啶，这导至基因甲基化信息转移到新形成的测序库中。

科学家们使用亚硫酸氢盐测序方法来分析所产生的单链中的5mC。这种技术可用于确定多个DNA甲基化事件；然而，克隆和测序过程等多个步骤使其成为一种耗时的方法。

这种方法的其他一些局限性包括：由于需要腐蚀性的化学条件，如低pH值和高温来实现脱氨，导至DNA样品的降解。因此，样品降解导至灵敏度下降，使其不适合分析低浓度的样品，如ctDNA。

然而，不那么积极的处理方法不能转化所有未甲基化的细胞嘧啶，因此，可能会高估甲基化的水平。

一种先进的基于测序的技术，即甲基化特异性PCR（MS-PCR）已经被开发出来，它避免了复杂的测序过程。

3.2、酶法

基于酶法的甲基化检测在温和的反应条件下具有很高的特异性，这意味着它可以实现与亚硫酸氢盐法相同的最终产品，而不损害DNA的完整性。

酶法甲基测序（EM-seq）可以检测5mC和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），使用三种酶，即T4-噬菌体β-葡糖基转移酶（T4-BGT）、Tet甲基胞嘧啶二氧酶2（TET2）和脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚单位3A（APOBEC3A）。

EM-seq是一个两步的反应过程：

➤  第一步涉及通过TET2和T4-BGT酶对5hmC进行葡糖基化，形成不能被APOBEC3A脱氨的产物；

➤  第二步涉及APOBEC3A酶，它通过将未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶来进行脱氨。

对甲基化敏感的限制性酶（MREs）的一些例子包括HpaII、BstUI、NotI和SmaI。这些酶只切割非甲基化的目标区域而保持甲基化的DNA完整。这些MRE切割物随后被测序以预测基因组水平的DNA甲基化水平。

最近，科学家们开发了一种先进的酶解技术，称为甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern（MS-RE-PCR）。

3.3、直接氧化和化学分解的氧化作用

科学家们已经开发了一种基于电化学的方法，用于直接分析DNA甲基化。

为了这项技术，设计了氯化胆碱单层支撑的多壁碳纳米管（MWCNTs）（MWCNTs/Ch/GCE）。这种技术具有高度的特异性、精确性和快速性，不需要使用酶、探针或亚硫酸氢盐。

另一种新的化学方法已经被开发出来，它是基于化学氧化分解，可以分离5mC。这种方法使用2-甲基-1,4-萘醌-色团的光敏氧化法。这种化学切断法能有效地检测出甲基化位点。

许多方法被用来研究DNA甲基化，而每种方法都有其自身的局限性。例如，如上所述，与基于双硫酸盐的方法相关的化学处理会导至DNA降解，获得较短的DNA片段用于进一步分析。

虽然长读测序技术被认为是一种高度准确的方法，但是采用这种方法时，需要好的工具（算法）来检测甲基化的位置。

另一个挑战是实现对整个哺乳动物基因组的覆盖，它有超过2500万个可被甲基化的CpG序列。为了对这些CpG中的每一个的甲基化状态进行定量分析，需要深度测序覆盖，但这很昂贵。

有一些更实惠的方法可以用来分析CpG的子集，但这些方法可能会错过一些关键的甲基化变化。

对于全面的DNA甲基化研究，可能需要大量的DNA，因此，当组织样本稀少时，分析就变得更加具有挑战性，有时很难区分5mC和5hmC。

异常的DNA甲基化与许多疾病有关，基于DNA甲基化的生物标志物可以帮助改善疾病的预后和治疗反应。

DNA甲基化领域的一个临床兴趣领域是利用改变的DNA甲基化模式进行癌症诊断。这些改变可以在液体活检中检测到，这些液体活检来自于患者的血液样本。

最终，根据无细胞血浆DNA中甲基化图谱的变化，早期检测癌症可能成为可能。如果良性或癌症前兆病变中存在的甲基化变化有可能促进其发展为恶性状态，这将是令人感兴趣的。目前有很多家公司正在努力开发基于甲基化状态和基于人工智能的病理预测的早期癌症检测试验。

从对肿瘤细胞的DNA甲基化景观的了解中，我们可以发现，DNA甲基化在肿瘤学领域出现了三种用途：

➤  发现新的疾病生物标志物，甚至可以在生物液体中检测到，并允许其病理分类；

➤  将某些基因中的DNA高甲基化事件作为治疗反应的预测因素，帮助癌症精准医疗；

➤  将DNA甲基化作为表观遗传药物的目标，如正在用于治疗血液学恶性肿瘤的DNA甲基化抑制剂。