相比变温技术PCR，恒温扩增技术更加多种多样，其所用酶的多样性，也就决定了恒温扩增原理的千差万别。即使这类方法统称为恒温扩增技术，但实际上每种方法的最佳反应温度也是各有不同的。不过，今天跟大家介绍的几种恒温扩增技术，则有一个共同的特点，那就是它们最开始的最适反应温度均为37℃左右。 重组酶聚合酶扩增技术(RPA) 1.原理介绍
2. 技术特点 (1)RPA为多酶反应体系，需多个酶的协作才能完成扩增，不同厂家基于关键酶的来源差别，建立了各自的扩增技术，如重组酶介导的扩增技术(Recombinase-aid Amplification, RAA)和酶促重组等温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification, ERA)，而从原理上看，此三种技术是类似的扩增方法； (2)RPA可于25~42℃反应，无须热循环，最适反应温度为37℃左右，该温度位于CRISPR/Cas系统的反应温度范围内，而两者的结合也推进了下一代分子诊断技术的发展(传说中的CRISPR/Cas分子诊断技术到底是个啥？)；(3)反应速度快，5~30分钟即可达到检出水平，适用于POCT领域；(4)扩增引物长度为30~35bp，荧光探针长度为46~52bp，相比其他核酸检测技术，引物和探针均较长，在测试中需要更多的摸索和筛选，同时较长的引物长度也限制了RPA对短序列核酸的检测。 3. 产品应用 (1)RPA是TwistDx公司的专利技术，后来雅培公司通过收购获得了该技术专利，其以RPA为基础的TwistAmp®核酸扩增产品，涵盖了DNA/RNA检测、实时检测/终点法检测，种类齐全，其提供的冻干试剂，无需冷链保存和运输。 (2)RAA是国内厂家的专利技术，主要有杭州众测生物科技有限公司和江苏省奇天基因公司在开发相应的检测试剂及设备，其中杭州众测生物科技有限公司结合RAA技术和CRISPR免疫层析法，开发出了新冠核酸检测试剂，并获得了NMPA注册证。(3)ERA则是苏州先达基因科技有限公司申请的专利技术，该公司创立于2017年，基于其核心技术开发的产品涵盖食品安全、畜牧水产、分子诊断等领域。 滚环核酸扩增技术(RCA) 1. 原理介绍 滚环核酸扩增技术(Rolling Circle Amplification , RCA)是模拟自然界微生物环状DNA滚环复制过程，建立起来的一种核酸检测方法。所用DNA聚合酶是具有强链置换活性的φ29 DNA聚合酶，扩增方法可分为线性扩增和指数扩增，其反应原理如图3所示：①对于环状模板，加入与模板互补的单引物，在引物和模板杂交后，即可启动滚环扩增，合成产物为重复的线形单链DNA序列，该过程为线性扩增(图3A)；②对于线性靶标序列，则可设计锁环探针(Padlock probe)，使其两端与靶标序列互补配对，并在连接酶作用下，将锁环探针连接成环，该环状序列即可作为模板进行滚环扩增(图3B)；③在单引物引发的线性扩增基础上，加入一条反向引物序列，该反向引物与单链DNA扩增产物结合，并在DNA聚合酶作用下进行复制，由于φ29 DNA聚合酶的链置换功能，因此可形成多分支扩增反应，使得产物呈指数递增(图3C)。
链替代扩增技术(SDA) 链替代扩增技术(Strand Displacement Amplification, SDA)是依赖于限制性内切酶(如HincII)对DNA酶切位点的切割，以及DNA聚合酶(如exo- Klenow)在切口位置的延伸，并置换下游DNA片段的一种恒温扩增技术。该技术在建立过程中，更新迭代了一次。第一代的SDA反应原理如图4所示：①第一代SDA使用1对含有限制性内切酶识别序列(如HincII识别5’-GTT//GAC-3’)的引物进行扩增，在扩增前需先用限制性内切酶对模板进行切割，再通过加热变性退火与引物结合；②在无外切酶活性的DNA聚合酶(如exo- Klenow)作用下，延伸形成DNA双链，并产生可被限制性内切酶识别的酶切位点，但由于反应体系中加入了一种化学修饰的dNTP(如dATPαS)，因此HincII只会切割酶切位点没被修饰的DNA链(如5’-GTT//GAC-3’或5’-GTT//GsAC-3’)，而另一条酶切位点含有半硫代磷酸化的DNA链则不会被切开，因此只是形成切口，并暴露出3’端，可作为DNA聚合酶延伸的引物，继续启动扩增，扩增产物再次形成可被识别的酶切位点，且为半修饰状态；③另外，DNA聚合酶延伸过程中将置换出下游DNA单链，被置换出的DNA单链可与引物结合启动扩增，同样形成含有半修饰酶切位点的DNA双链，限制性核酸内切酶再次识别酶切位点并切割；④由此，限制性内切酶形成缺口、DNA聚合酶启动扩增与链置换反应循环进行, 从而形成循环反应过程。
(1)SDA在等温扩增之前需要一个加热变性打开双链的步骤，若所用酶不耐热，则需分步添加；(2)SDA反应体系中需通过添加经化学修饰的核苷酸，确保限制性内切酶仅在酶切位点形成切口，其中加入的非标准核苷酸将降低扩增效率；(3)与SDA类似的恒温扩增技术还有切口酶扩增反应(Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR)，该方法所用内切酶为切刻内切酶，只水解双链 DNA 中的一条链，对 DNA 链进行切刻而不是切断，从而形成切口，因此体系中可使用正常的核苷酸进行扩增，且该方法所用酶具有热稳定性，反应温度可达到54℃左右，该技术最为人所知的产品，就是雅培ID Now平台的检测试剂。 解旋酶依赖性扩增技术(HDA)
(1)与其它恒温扩增技术相比，扩增过程简单，简直就是PCR的恒温版本；(2)扩增过程需要解旋酶和聚合酶协同作用，需平衡两者的反应速度，使得反应趋向于合成新链；(3)HDA最开始的反应温度为37℃，后来通过对关键组分的筛选调整和基因工程改造，最后形成了热稳定HDA，反应温度可达到65℃左右。 总结与思考 参考资料 [1] Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006 Jul;4(7):e204.[2] Babu B, Ochoa-Corona FM, Paret ML. Recombinase polymerase amplification applied to plant virus detection and potential implications. Anal Biochem. 2018 Apr 1;546:72-77.[3] Goo NI, Kim DE. Rolling circle amplification as isothermal gene amplification in molecular diagnostics. Biochip J. 2016;10(4):262-271.[4] Yan L, Zhou J, Zheng Y, Gamson AS, Roembke BT, Nakayama S, Sintim HO. Isothermal amplified detection of DNA and RNA. Mol Biosyst. 2014 May;10(5):970-1003. [5] Zeng L , Mukama O , Lu X , et al. Strand Displacement Amplification for Multiplex Detection of Nucleic Acids[M]. 2018.[6] Barreda-García S, Miranda-Castro R, de-Los-Santos-álvarez N, Miranda-Ordieres AJ, Lobo-Castañón MJ. Helicase-dependent isothermal amplification: a novel tool in the development of molecular-based analytical systems for rapid pathogen detection. Anal Bioanal Chem. 2018 Jan;410(3):679-693. |
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