重磅解读丨中检院病原mNGS联合研究中文版

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概 述

背景：病原宏基因组高通量测序技术（mNGS）已广泛应用于临床感染性疾病病原学诊断，然而目前大多数研究对该项技术的评估还不够全面和细致。

方法：本研究通过设计病原微生物参考品及其相关性能评价指标，对17家单位的mNGS检测试剂的性能进行质量评价，重点关注mNGS技术的检测可靠性、关键影响因素、精密度以及该技术用于定量检测的潜力。

结果：研究发现，不同的mNGS 检测试剂、对于不同种类的病原微生物，其检测性能表现出显著差异。常规情况下，20M测序数据量（2000万条测序序列）性价比高，可以满足检测性能需求。基于测序序列数可用于推测微生物的相对丰度。

总结：mNGS检测性能受到微生物种类、人源宿主核酸含量、测序数据量等因素的显著影响。对于不同的mNGS试剂，其操作流程和测序平台、检测结果的假阳性问题等，均是mNGS检测准确性和定量面临的技术挑战。本研究建议，对于mNGS检测试剂，至少应在临床样本常见的人源细胞背景下（10⁵ cells/mL），实现24小时内，20M测序数据量的情况下，具备≥500 CFU/mL（或copies/mL）病原微生物的灵敏度性能。

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实 验 设 计

研究选择革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒共19属、30种病原微生物，严格设计并制备9份参考品。所选病原体在病原种类、基因组大小、GC含量等方面覆盖广泛，可用于代表实际临床样本中病原体的多样性（图1a）。

图1a 30种病原体种类与GC含量分布

9份参考品中，1份是阴性对照，另外8份参考品分为高含量组（PRH）和低含量组（PRL），并且高低含量组两两配对，其宿主细胞核酸的含量相同，虽病原体种类也相同，但其含量比值为5：1。同时每份参考品样本稀释10倍，用于评估mNGS定量效果(图1b)。

图1b  9份参考品设置图

9份参考品分发给17个实验室进行盲测与生物信息分析（17个实验室共有4种前处理方法，2种核酸提取方法，3种文库构建方法，6种测序平台，4种生信分析流程）。评估mNGS检测结果灵敏度（按召回率Recall计算所得）、特异性（按精确率Precision计算所得）和准确率（按F-score计算所得，精确率和召回率的综合评估指标）（图1c）。

图1c  （1）多中心研究计划总览（2）结果回收后mNGS检测性能评估指标与计算方式（准确率F-score、灵敏度Recall、特异性Precision）（3）检测流程关键环节可选方法概览（如核酸提取选择有柱提法和磁珠法2种）

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各实验室mNGS检测性能评估结果

各实验室室间检测能力差异显著（图2a）。 F-scores这一指标得分在0.5-1之间，平均F-score为0.81，其中有两家总体得分为1（检测准确，无多报，无少报）；召回率（评估灵敏度）平均为0.88，室间差异较小（0.75-1.0）；精确率（评估特异性）平均为0.77，室间差异较大（0.45-1.0）。

图2a 各检测单位的召回率、精确率、准确率得分情况

实验室间检测性能差异主要体现为假阳性的判断能力。具体分析各实验室出现的真阳性、假阳性、假阴性物种，发现室间真阳性与假阴性结果较为一致，而假阳性物种数量室间差异大。另外，实验室间真菌和RNA病毒的检测能力差异大（图2d）。无论是低含量或高含量组，所有种类微生物中RNA病毒检测最具挑战，平均召回率只有0.71。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌召回率最高（0.96和0.94），其次为DNA病毒（0.89）和真菌（0.80）。

图2d 各病原体类型的召回率

（RNA病毒平均召回率相对其他病原体低）

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更深的本土化，

超mNGS灵敏度受微生物与宿主核酸比率影响

微生物与宿主核酸比率是影响mNGS检测灵敏度的关键因素。结果显示，无论参考品是否进行1:10稀释，高含量组与低含量组检出序列数仍然呈现5倍差距，且稀释前与稀释后检出序列数没有差异。按细菌、病毒、真菌分类后，依然观察到相似的模式（图3 a、b）。该结果指出微生物与宿主核酸比率不变的情况下（如1:10稀释），虽然参考品中病原体浓度降低，但检测灵敏度并未受到显著影响，即mNGS的检测灵敏度需要综合宿主核酸与微生物含量两个因素，而不是只考虑微生物含量。

图3 病原体相对含量、绝对含量（如稀释）（a）及类别（b）等因素对mNGS灵敏度的影响

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室间或室内微生物丰度比较

室内结果表明mNGS可以实现病原体相对定量。通过微生物投入量，基因组大小等参数计算的期望丰度值与实际丰度符合线性回归，即可以通过线性回归模型等实现微生物的相对含量推测。

室间结果表明不同实验室测出来的RPM（Reads per Million, 每1M数据量测到的序列数）差异显著（图3e），因此室间比较病原体丰度的价值有限。去宿主核酸和柱提法会产生较高的RPM，研磨破壁步骤会使RPM变低（图3f）。研究者推测原因可能是去宿主核酸有助于提高各种微生物检出率，研磨破壁可能降低RNA病毒检出率。

图3e 各实验室间RPM差异显著

图3f 研磨破壁、去宿主核酸、柱提法等不同实验室操作方法与微生物丰度的关系

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mNGS精密度受实验室流程影响

为了评估mNGS检测结果的精密度，研究者应用收集到的各实验室报告的结果，评估每一检测点检出序列的变异系数（CV，coeffecient of variations）。各检测点的CV分布在0.12~1.1之间，平均CV为0.65。

不同检测流程比较中，去宿主核酸流程CV较低，可能是因为去宿主核酸后提升病原体序列数，促使结果更稳定；核酸内切酶建库法的CV（0.4）显著低于转座酶建库法的CV（1.0），表明转座酶建库法是导至结果差异的重要步骤，可能原因是该方法相较对文库构建过程中的DNA输入量比较敏感（图4b）；不同种类微生物检测中，真菌检测CV最高，结果最不稳定。

图4b 不同检测流程下检测结果的变异系数

研究者进一步探究测序数据量相关抽样噪音对检测精密度的影响。发现模拟抽样噪音产生的差异总是低于观察到的总体差异，表明除了测序相关因素外，其它实验因素对精密度也产生相当大的影响。以上结果表明当设计方案评估宏基因组检测时，需要充分考虑不同实验因素带来的影响；在更好的理解和控制不同实验因素产生影响前，精准定量病原体颇具挑战。

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mNGS灵敏度受测序数据量影响

相较于核酸提取，文库构建等步骤，样本前处理对检测性能影响较大。其中去宿主核酸可以显著提高检测性能，而研磨破壁技术并不一定能够起到好的效果，总体上是降低了病原体尤其是RNA病毒的检测性能。其它检测流程的差异与检测性能没有显著相关性。

测序数据量是影响宏基因组检测结果的关键因素。一般来说20M数据量可以满足绝大部分检测需求。随着测序数据量增加，mNGS检测性能逐步提升，而到10M后逐步达到平台期。从本次所有参与的实验室结果来看，达到20M测序数据量时，已经可以检测到绝大部分本次设计中的微生物，随后继续增加测序深度，收益显著下降（图5c）。

分微生物种类来看，5M数据量时，真菌检测达到平台期，10M数据量时，细菌检测达到平台期，20M数据量时，病毒检测达到平台期（图5d）。检测结果也与先前的推论符合，即mNGS检测灵敏度与微生物基因组大小相关，病毒等小基因组物种需要更多的测序数据量。

图5 样本维度（c）及病原体种类维度（d）测序数据量对召回率的影响

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mNGS检测特异性受到背景微生物的挑战

背景微生物引起的假阳性将会影响mNGS的特异性。探究假阳性的原因，总体分为四类：交叉污染、背景微生物、错误种属鉴定、病毒错误分型。其中，背景微生物（49%）和错误种属鉴定（39%）是最主要的假阳性原因（图6c、d），不同实验室间的表现差异也是最大的，而比对算法差异不是导至错误种属鉴定的关键因素。

背景微生物主要受湿实验流程影响，它既可以来源于通用流程，也可来源于各实验室的特有流程。不同实验室需要有各自的方法排除干扰，提高检测精确度。另外，研究发现高背景微生物不一定代表更差的检测表现，表明除了要减少背景微生物外，有效的背景微生物数据过滤也十分重要。

另外，研究者发现真阳性物种具有比较高的基因组覆盖度和较低的片段序列测序深度，基于此可从假阴性里找回部分真阳性结果。假阳性物种具有显著较低的基因组覆盖度，同时背景微生物导至的假阳性物种具有显著较高的片段序列测序深度。根据上述发现，本研究通过机器学习的方法，设置了一个假阳性过滤器，可以有效的减少假阳性物种（34种减少到11种），同时不会影响真阳性物种。

图6 各实验室报告背景微生物数量（c）及假阳性原因（d）

本研究面向17个实验室，应用各单位的mNGS检测试剂对9份模拟呼吸道和脑脊液临床样本的参考品进行检测，并对检测结果进行了统计和分析。本研究是目前为止，最深入、最全面的mNGS检测试剂质量评价联合研究。本研究条件下，对于病原体检测需求，20M测序数据量基本可以满足。由于mNGS技术的复杂性，对于其它类型的临床样本或非典型标本，需要慎重考虑或评估测序数据量。宿主核酸含量会极大影响宏基因组病原微生物检测灵敏度性能，去宿主核酸有益于提高检测灵敏度，但应进行充分验证。目前，有众多去宿主核酸方法，应用前需要经过验证，确保这些方法不会非特异性的去除病原体。

同时也应注意本研究的局限性。参考品不能完全代表临床样本，比如真实临床样本中还含有许多游离核酸；本研究无法确定在真实临床样本中，破壁流程和不同的建库方法会不会产生显著差异；此次研究是由不同检测平台与流程，共同检测同一批参考品，检测结果有助于发展和优化病原检测流程。