核酸分子检测试剂的阳性质控品类型

  在核酸分子检测试剂开发中，除了反应体系的主要原材料（如引物探针、酶、缓冲液等）外，获得阳性质控品，以作体系测试验证材料，同样必不可少。没有靶标样品的研发测试，就如同无米之炊，体系的工作情况也就无从评估。因此，只有获得正确有用的阳性质控品，才能为产品的开发奠定基础。实际上，在阳性质控品的选择时，我们不仅要保“质”，也要求“量”。

一、临床样本

1.来源

临床样本直接取自检测对象，是较为理想的阳性质控品，也是临床检验中最真实的样本。原始的样本，具有完整全面的样本状态，涵盖了采样器材、保存介质和个体特质等信息。

2.优缺点

(1)优点：直接取自检测对象的实际样本，可真实反映产品使用时的全过程性能；同时真实样本含有的完全病原体状态（结构或基因序列完整），能够为研发提供灵活全面的测试要求。

(2)缺点：临床样本来源有限，无法稳定供应，而且不同样本间可能存在异质性，造成检测结果存在差异，影响产品的前期开发测试；另外，真实样本带有生物传染性，存在潜在的安全风险。

二、培养物

1.来源

真实临床样本的不可持续性和不确定性，易造成一锤子买卖，不利于研究测试。因此，对于一些可分离培养的病原体，人们在获得其种子株后，后续便可通过培养获得完整病原体。目前已有一些商业化的菌种库或病毒库，企业可从中购买病原株，再根据病原体特性，提供合适的条件，自行进行扩大培养。或者，也可从有资质的企业或机构中，直接购买培养物用于测试。

2.优缺点

(1)优点：人工培养，可连续制备，阳性质控品的来源稳定可靠；同样也是完整的病原微生物，可用于模拟真实临床样本，稳定性较好；

(2)缺点：菌种或病毒株来源有限，部分病原体（如病毒）难以通过培养获取；企业自行制备时，需有相应资质要求。

三、人工合成样本

1.质粒DNA

(1)来源

通过PCR扩增或化学合成获得目的基因片段后，将该片段插入质粒载体中，形成含有目的核酸序列的重组质粒，再将该重组质粒转化导入宿主中，筛选获得目标克隆，后续便可通过培养，获得大量含有目的核酸序列的重组质粒。

 (2)优缺点

①优点：人工合成的DNA质粒，核酸序列明确；将目标序列插入质粒中，可稳定保存，也便于生产制备，成本较低；无感染性，使用起来安全方便。

②缺点：质粒为DNA序列，无法评估RNA的逆转录过程，也无法监测病原体的提取性能。

2.体外转录RNA

(1)来源

通过PCR扩增或合成等方法获得带有转录启动子序列的DNA片段，然后在RNA聚合酶（如T7或SP6等）作用下，转录生成含有目标核酸序列的RNA，再利用DNase消化去除DNA后，经过纯化获得目标RNA。另外，对于短片段的RNA，也可直接通过化学合成获得，无需体外转录过程。

 (2)优缺点

①优点：核酸序列明确，可重复制备生产，无感染性。

②缺点：裸露的RNA，保存稳定性较差，也不能监测样本的提取过程。

3.假病毒

(1)来源

假病毒是一类嵌合型病毒颗粒，利用病毒载体在宿主中的自主包装特性，形成含有目标核酸序列的蛋白颗粒。在核酸分子检测中，常用于制备阳性质控品的假病毒包装系统有三种：

①慢病毒

慢病毒(Lentivirus)是反转录病毒科中的一个属，因其感染个体后，潜伏期较长而得此名，包含人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血(EIA)、猫免疫缺陷病毒(FIV)等。其中，以慢病毒为载体制备的假病毒，多是在HIV-1基因结构基础上建立起来的。

HIV-1编码的蛋白，根据其功能可分为三类：结构基因(gag、pol、env)、调节基因(tat、rev)和辅助基因(nef、vpr、vpu、vif)。其中gag、pol和env是慢病毒生存所需的基本基因，也是假病毒表达组装的基本结构蛋白。

在制备假病毒时，为了安全考虑，人们剔除了慢病毒的致病基因，也删除了一些非必要的附属基因，并把各功能基因分割至不同质粒中，形成了目前常用的第二代三质粒系统和第三代四质粒系统。

以三质粒系统为例，将含有目的核酸序列的转移质粒(Vectorplasmid)、包装质粒(Packing plasmid)和包膜质粒(Envelop plasmid)共转染宿主细胞(如293T)后，将在细胞内表达组装慢病毒，形成携带目的核酸序列的假病毒颗粒。由于慢病毒基因组为RNA，因此其组装而成的假病毒核酸物质为RNA。

②腺病毒

腺病毒(Adenoviru)是一种无包膜的线性双链DNA病毒，其中人腺病毒已知有50余种血清型。目前常用的腺病毒载体主要是基于血清型5(Ad5)建立的，其基因中的E1和E3被人工敲除，形成复制缺陷型病毒。其中，E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可通过宿主细胞得到补充，而E3基因则不影响病毒的包装。

在制备腺病毒载体时，先将目的基因克隆至穿梭载体(Shuttle vector, 如图中的pAdTrack-CMV)后，再将其重组到腺病毒骨架质粒(Adenoviral backbone plasmid, 如图中的pAdEasy-1)上，最后在表达E1的宿主细胞系(如293细胞)中组装形成假病毒颗粒。由于腺病毒基因组为DNA，因此其形成的假病毒颗粒包裹的核酸序列为DNA。

③噬菌体

噬菌体(Phage)是一类感染细菌等微生物的病毒总称，其结构跟其它病毒一样，由其蛋白质外壳包裹着遗传物质(DNA或RNA)。目前用于制备假病毒的噬菌体大部分为侵染大肠杆菌的病毒，如大肠杆菌噬菌体MS2。

噬菌体假病毒制备时，先将含有大肠杆菌噬菌体MS2外壳蛋白的基因序列以及目标基因克隆到表达载体中，该载体可转录生成含有目标基因片段的RNA，同时其表达的MS2外壳蛋白，可将转录生成的RNA包裹形成RNA-蛋白质复合体，即噬菌体假病毒，也称为装甲RNA(Armored RNA)。另外，一些噬菌体的基因组可以是DNA，因此也可用于制备DNA假病毒。

(2)优缺点

①优点：假病毒核酸片段序列明确，生物安全性高；其结构与真病毒类似，蛋白外壳包裹着核酸，增强了核酸的保存稳定性，同时也可用于监测病原体的提取过程。

②缺点：假病毒的制备受一些专利保护，制备过程较为繁琐，而且由于病毒表面结构的差异，还无法充分模拟真实样本

四、总结

在核酸分子检测产品开发过程中，从反应体系的建立，到产品性能的验证，直至定型产品的质控，都离不开阳性质控品。只有获得品质合格的质控品，才能准确评估体系的优劣。

临床样本作为最优样本、培养物作为次优样本，在研发评估测试中的重要地位固然不容置疑，但受限于其来源不稳定、潜在风险高等因素，它们在前期研发测试中的使用频率并不高。特别是面对新发病原体时，样品本来就稀有、安全性更不可知，而体系又要评估，那么人工合成的样本便可就此展示其实用性。DNA质粒合成、RNA体外转录，这些制备周期短、生成量大的质控品，在前期研发测试中便可起到应急作用。而进一步，制备成相应的假病毒，就能更好的评估反应体系。特别是在RNA病毒检测时，假病毒的稳定性是体系测试的质量保障。

综合起来，作为核酸分子检测的阳性质控品，其来源和性能应足够稳定，使用时可监测样本从处理到检测的全过程，同时应具备较高的生物安全性。