核酸扩增试剂常用酶原料

酶，作为核酸扩增检测试剂的主要原材料之一，其关键作用不言而喻，其在分子诊断产品成本中更是具有举足轻重的影响。而在“国产替代”、“集采”等大环境下，实现核心原料国产化的企业，也将拥有更多的机会与主动权。现在，我们不妨先看看核酸扩增的常用酶有哪些？

一、PCR常用酶

1.尿嘧啶DNA糖基化酶

尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)又称尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)，可水解含尿嘧啶的单链和双链DNA释放出游离尿嘧啶，而对RNA无活性，与dUTP搭配使用，可建立成PCR防污染体系。其原理如下：在PCR体系中将dTTP部分或全部替换为dUTP后，使得反应生成含有dU碱基的扩增产物，这些扩增产物不同于天然模板，在进入含有UDG酶的反应体系时，可被UDG酶识别并切割尿嘧啶碱基与糖磷酸骨架间的N-糖基键，而经切割后的DNA链在碱性或高温条件下易于断裂降解，从而失去被当作模板再扩增的能力，因此可防止扩增子污染（如下图）。

市面上的UDG酶主要有普通型和热敏型，其中热敏型UDG酶在室温条件下即可催化反应，50℃以上加热可使其灭活，防止其降解后续PCR形成的含dU扩增产物。

虽然UDG/dUTP体系具有防污染功能，但在实际测试中还得兼顾PCR的效率和灵敏度。一方面需确保PCR扩增产物掺入足够量的尿嘧啶碱基，从而可被UDG有效切割；另一方面也需要保证反应体系添加的dUTP不会明显影响PCR效率，因此dTTP和dUTP的最佳比例需通过优化确定。

2.逆转录酶

逆转录酶又称反转录酶，是一种RNA介导的DNA聚合酶，其反应过程中体现出三种功能为：①以RNA作为模板合成互补DNA链 (complementary DNA, cDNA)，形成RNA:cDNA杂交链；②发挥RNase H活性，降解RNA:DNA杂交链中的RNA模板；③以cDNA作为模板合成第二链DNA，形成双链DNA（如下图）。

其中，RNaseH活性是逆转录酶的一个内在特性，可在合成过程中同时切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板，该特性可能降低逆转录效率，因此在实际应用中，常采用人工改造后的低或无RNase H活性的逆转录酶。常用的逆转录酶有AMV和M-MLV，AMV分离自禽类成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus, AMV)，M-MLV逆转录酶分离自莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV)，前者热稳定性优于后者，但AMV逆转录酶的RNaseH活性也更强，不利于长片段cDNA合成。市面上多使用经基因工程改造过的M-MLV逆转录酶，其热稳定性改进，可在50℃左右工作，同时RNase H活性进一步减弱，提高了其逆转录效率。

3.Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是从水生噬热杆菌(Thermus aquaticus)中提取获得的热稳定DNA聚合酶，可以DNA作为模板合成DNA。因其出色的热稳定性，可结合温度循环变换过程，在体外完成DNA的复制。目前体外诊断试剂常用具有热启动(Hot start)功能的Taq DNA聚合酶，该类酶通过修饰抑制其在低温条件下的活性，防止其在未达到预设温度时出现非特异性扩增，只有在温度升高后，解除抑制，才释放酶活性，从而进入PCR循环扩增过程。常用的TaqDNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、抗体修饰和配体修饰。

化学修饰一般采用化学反应使一些化学小分子（如酸酐等有机物）与聚合酶上的侧链氨基酸(赖氨酸)反应封闭酶活性，只有温度升高后，酸酐与氨基之间的化学键断裂，才表现出DNA聚合酶活性。一般情况下，化学修饰的聚合酶高温启动时间相对较长。

抗体修饰是在Taq DNA聚合酶中添加抗体封闭其活性，使其在低温下无法启动扩增，直至反应体系温度升高使得抗体变性脱落后，DNA聚合酶才被释放活性并启动扩增。抗体修饰的酶活性释放速度快，但抗体与Taq DNA聚合酶的配比需通过优化确定，以便两者达到动态平衡过程。

配体修饰主要借助核酸适配体封闭酶活性，该类适配体多为一段具有特异性识别功能的寡核苷酸分子，可形成特定的空间构象，通过非共价键与Taq DNA聚合酶结合，进而抑制其在非许可温度下的聚合反应。配体修饰的聚合酶活性是可逆的，且热激活温度相对较低。如下图所示的配体修饰酶，在温度达到60℃时则释放DNA聚合酶活性；当温度降低至55℃以下时，则酶活性又可被重新封闭（如下图）。

4.Pfu DNA 聚合酶

Pfu DNA聚合酶来源于嗜热古细菌(Pyrococcus furiosis)，是一种高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5'→3'外切酶活性，但具有3'→5'外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物碱基错配率降低，且其PCR产物为平末端。主要用于保真度要求比较高的PCR反应，如克隆PCR、基因定点突变和全基因合成等。

二、恒温扩增常用酶

恒温扩增的方法多种多样，其对应的酶体系也各有差别，且一般为多酶体系，在酶原料选择上相比PCR复杂，下面只列举一些主要的恒温扩增方法相关酶。

1.LAMP相关酶

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)所用酶主要为具有链置换功能的DNA聚合酶，详细原理可参考聊聊恒温扩增技术-LAMP & CPA。

常用酶为Bst DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能；若检测模板为RNA，则可加入逆转录酶配制成RT-LAMP反应体系。

2.TMA相关酶

依赖转录介导扩增(Transcription mediated amplification, TMA)的扩增模板为RNA或单链DNA，检测的扩增产物为RNA，详细原理可参考转录介导的核酸扩增技术小结。

该体系所用酶有两种：①M-MLV逆转录酶：用于模板RNA逆转录成DNA，并在逆转录过程中通过引物引入转录启动子序列，用于后续转录过程；②T7 RNA聚合酶：以逆转录形成的DNA为模板，转录合成检测产物RNA。

3.RPA相关酶

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是一种多酶协作的反应体系，详细原理可参考充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA。

该体系反应酶包含三种：①重组酶：可与引物结合形成复合体，定位至与引物同源的靶序列，促使引物与模板结合，同时帮助DNA解链，以便启动扩增；②单链DNA结合蛋白：可与被置换出的DNA单链结合，稳定单链结构；③DNA聚合酶：如Bsu DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能。

对于RNA模板，需在反应中加入逆转录酶形成RT-RPA体系；若利用标记探针进行检测，还需加入核酸酶对探针序列进行切割，常用核酸酶有核酸内切酶 IV(Endonuclease IV, nfo)和核酸外切酶 III(Exonuclease III, exo)，或者可与CRISPS/Cas系统搭配使用。

4.NEAR相关酶

切口酶扩增反应(Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR)是一种基于切刻内切酶切割特性的恒温扩增方法，详细原理可参考啥黑科技可10分钟完成核酸分子检测？。

其使用的酶有两种：①切刻内切酶：如Nt.BstNBI切刻内切酶，该类酶不同于常规限制性内切酶，其识别特定序列后仅在DNA其中一条链上切割形成缺口，并暴露出游离的3’端；②DNA聚合酶：如Vent (exo-) DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能。

5.HDA相关酶

解旋酶依赖性扩增技术(Helicase-Dependent Amplification, HDA)也是一种多酶协作的反应体系，详细原理可参考充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA。

反应体系的三个主要酶是：①解旋酶：如UvrD解旋酶，用于解开DNA双螺旋结构，以便形成单链；②单链DNA结合蛋白：可与解链后的DNA单链结合，稳定单链结构；③DNA聚合酶：催化合成DNA链，常用Bst聚合酶或Klenow聚合酶等。

6.RCA相关酶

滚环核酸扩增技术(Rolling Circle Amplification , RCA)是模拟自然界微生物环状DNA滚环复制过程的检测方法，其模板进入扩增前需为环状结构，详细原理可参考充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA。

RCA使用的是具有强链置换和连续合成特性的φ29 DNA聚合酶；而对于线性模板，还需利用DNA连接酶催化反应形成环状模板后方可进入扩增；此外，该方法无需使用逆转录酶即可用于检测RNA。

7.SDA相关酶

链替代扩增技术(Strand Displacement Amplification, SDA)扩增原理类似于NEAR，只是选择了限制性内切酶对DNA酶切位点进行切割，详细原理可参考充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA。

该体系含有两种酶：①限制性内切酶：如限制性内切酶HincII，用于特异性识别酶切位点并切割DNA链，但由于反应中引入化学修饰的碱基，因此只切割其中一条酶切位点未被修饰的DNA链，从而仅形成切口；②DNA聚合酶：如Klenow (exo-) DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能。

三、双功能酶

1.Tth DNA聚合酶

Tth DNA聚合酶是分离至嗜热细菌(Thermus thermophilus)的热稳定性酶，兼具逆转录和DNA聚合酶活性。在Mn²⁺条件下，主要表现为逆转录酶活性，即以RNA为模板合成DNA；而在Mg²⁺条件下，则具有较强的DNA聚合酶活性，以DNA为模板合成DNA。由于该酶可耐受较高温度，因此逆转录步骤可在较高温度下进行，但该酶表现出的活性依赖于不同的二价阳离子，在RT-PCR体系中较难兼容，其逆转录酶活性往往达不到预期，因此在实际使用中，有时还需添加逆转录酶确保逆转录效率。

2.RevTaq RT-PCR DNA聚合酶

RevTaq RT-PCR DNA聚合酶是经人工定向改造后的耐高温双功能酶，同时具有逆转录酶和DNA聚合酶活性。该酶不同于Tth DNA聚合酶，其逆转录酶活性无需Mn²⁺参与，在PCR循环扩增过程中即可同步进行逆转录步骤，实现 “zero-step” RT-PCR。因此其逆转录过程可在较高温度下进行，引物需相应设计为较高的Tm值。

3.Bst 3.0 DNA聚合酶

Bst 3.0 DNA聚合酶是在Bst DNA Polymerase I(大片段)基础上改造并融合了新型的核酸结合域，使其等温扩增效率提高，逆转录活性也增强，因此可直接用于单酶体系的RT-LAMP。

四、小结

对于RNA模板，通常需加入逆转录酶参与扩增反应，该酶的活性也直接决定了检测的效率。虽然市面上也有包含逆转录酶活性的双功能酶，但其应用范围依然较小。不过，双功能酶实现RNA的单酶检测，抑或“零步法”RT-PCR，总让人充满期待。

多酶系统直接增加了原料成本，在体系优化上也提高了难度，但也正是多个酶的巧妙组合，才成就了各种各样的恒温扩增方法。

另外，人工定向改造，也为酶功能带来了无限可能，更是在扩增检测方法上，给人带去更多的想象力。