诊断技术｜诊断用抗体的亲和力和多样性

值得注意的是，体外抗体不受天然B细胞受体（BCR）进化中普遍存在的动力学结合限制，因此，理论上有可能使用现有的显示技术从重组抗体文库中分离出非常高的亲和力。

这取决于文库的质量，即内在的多样性和使用的选择严格性。

通行率，即一个抗体结合其同源抗原的速率，总是在很大程度上由限制性因素决定，如抗体的大小和电荷，这影响了在特定基质中的扩散常数，当体外选择是在抗原涂层的孔或免疫管的静态孵化条件下进行时，就变得特别有限制性。

因此，以亲和力为基础的选择，在设计时考虑了适当的严格性（降低抗原浓度和增加洗涤步骤），以鼓励更高的亲和力结合，经常返回“命中”，在kd方面比ka更广泛和极端。

表面等离子体共振（SPR）（我们将在后续的文章中进行更详细的描述）已经成为测量抗体-抗原相互作用的标准技术。

它之所以受到青睐，是因为它可以实时监测结合事件（图2），而且不需要辅助标签。累积起来，这些属性可以实现稳健的分析和忠实的动力学常数的返回。

通常情况下，将脱落率与抗体-抗原复合物的半衰期（t1/2）联系起来是比较容易的。这简单地反映了50%的复合物解离所需的时间与浓度无关，并且可以很容易地被解析为t1/2 = ln 2/kd。

例如，对于10^-4(s^-1)的脱落率，达到50%解离的时间将是115.5分钟。一些噬菌体展示的参与者经常采用与自由抗原竞争的方式作为洗脱的具体手段，或者在洗脱结合更紧密的克隆之前，专门耗尽结合较弱的克隆。

图2|一个典型的SPR传感器图谱。目标分析物与固定在传感器芯片表面的同源配体（抗体）的结合被实时监测并以任意反应单位（RUs）报告。抗体的亲和力（平衡解离常数KD）很容易从解离（“off-rate”，koff或kd）和结合（“on-rate”，kon或ka）的比率中得到解决，根据KD = kd/ka。

使用合成化学和分子生物学工具完全在体外产生人工多样性是可能的。

与原始库一样，这些库也不需要免疫，更重要的是，它们可以颠覆耐受性，因此，在处理难以分离的抗体（如针对人类生物标志物和治疗目标的抗体）时，越来越成为库的类型选择。

同样地，它们可以很容易地针对有毒的目标分析物进行筛选。

从实用的角度来看，在任何抗体选择活动中，克隆输出群体的组成往往会受到表达偏差的严重影响。

尽管表达可能受到互补性决定区（CDR）异质性的影响，特别是当含有不加区分的半胱氨酸和终止密码子时，它往往是累积框架贡献的更直接反映。这一点至少可以通过在一个经过充分验证的默许框架内仔细设计合成多样性来部分规避。

由此产生的表达的正常化，将被理解为对筛选活动有巨大的转化影响，并有利于更无缝地同化到高通量（HT）平台。

因此，由于DP47（VHIII）在人类表达谱系中的明显过度代表，DP47（VHIII）种系可变重域被认为是特别适合人类合成抗体库的通用重链支架，它具有卓越的热力学稳定性。

同样地，一组有限的、代表性过强的轻链种系框架（如DPK22（VkIII））经常被纳入。

事实上，非常明显的轻链非活性反映了离散重链的高度杂乱性，当然，在最早的开创性半合成库中，这种明显的“通用轻链”被利用来证明从CDRH3限制的多样性中进行亲和分离的可行性。

在治疗环境中，对框架的选择给予应有的注意有助于确保候选治疗性抗体不太可能影响病人的免疫系统，尽管CDR区域本身仍有可能刺激不良免疫反应。幸运的是，除了一些临床诊断应用外，后一种情况是在更广泛的诊断领域中构成较少的限制。

绝大多数报道的合成文库都是根据大量的、不断增长的抗体序列数据库设计的，这些数据库可以识别关键残基，并对突变残基有更深的了解。

人们不禁想到，在抗体工程革命的这个阶段，这样的基础是相当保守和安全的，也许，特别注重治疗的限制。诊断领域有机会更充分地探索并确实利用传统和更新颖的库设计所能提供的全部好处。

如果库被适当地设计和构建，以便偏向于目标特定的特征（例如用于裂隙结合的长环或偏向于疏水性），那么可以合理地预期这样一个合成抗体库可能会有信心地返回一部分潜在的结合奇异性。

然而，这样的硅设计完全依赖于对目标结构和精确表位定义的全面先验知识。可以说，这实际上是对天然免疫复合物的更准确的表述，因为它是在强有力的刺激和唤起记忆反应后构建的。

这种设计无疑将受益于对确定的免疫原或免疫原类别反应的B细胞偏向的更全面的挖掘，这种做法因越来越多的高通量测序设施而成为可能。

这也可能涉及对可容忍的和有贡献的功能多样性的反复探索，从纯粹的CDR-H3为重点的最小化，甚至是二元限制的多样性，到更广泛地包括可能有助于构象复杂性和附加有利的热力学稳定和结合能量的非paratope残基。