流式信号报告分子

有机小分子荧光染料如Fluorescein(MW=389 D), Alexa Fluor 488 (fluorescein类似物), Texas Red (325 D), Alexa Fluor 647 (1464 D), Pacific Blue 和 Cy5 (762 D) 等。它们具有一致的发射光谱，但Stokes位移很小（激发波长和发射波长之间的差异，大约 50-100 nm）。它们也很稳定，很容易与抗体偶联。Alexa Fluor (Thermo Fisher) 染料被设计为对光漂白更具抵抗力，并很好地适用于成像分析。

藻胆蛋白是来自蓝藻、鞭毛藻和海藻的大蛋白质分子。它们是大分子，例如藻红蛋白 (PE) 的分子量为 240,000 D。这些蛋白质具有大的Stokes位移 (75–200 nm)，并且非常稳定，具有一致的发射光谱。由于它们的大尺寸，藻胆蛋白非常适合定量流式细胞术，因为它们在结合过程中通常具有 1:1 的蛋白质与荧光染料的比率。然而，藻胆蛋白易受光漂白影响，不推荐用于长时间或反复暴露于激发源的应用。藻胆蛋白包括有藻红蛋白 (PE)、别藻蓝蛋白 (APC) 和藻黄素叶绿素蛋白 (PerCP)。

量子点 (Qdots) 是半导体纳米晶体，具有与纳米晶体尺寸相关的紧密荧光发射光谱。它们用紫外或紫色激光进行最佳激发，但可由多个激光不同效率地激发。当 Qdots 用于多参数实验时，这种交叉激发使荧光补偿复杂化。由于补偿问题和将 Qdots 与抗体结合的困难，这些试剂在多参数染色面板中已在很大程度上被高分子染料取代。

高分子染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基“调整”以吸收和发射特定波长的光。这些染料非常稳定，具有与藻胆蛋白相似的量子效率，但光稳定性大大提高。由于可以使聚合物染料仅吸收特定波长的光，因此它们避免了多次激光激发导至 Qdot 试剂难以用于多参数实验的问题。这些染料包括亮紫 (BV)、亮紫外 (BUV) 和亮蓝 (BB) 。

串联染料将藻胆蛋白（PE、APC、PerCP）或聚合物染料（BV421、BUV395）与有机小分子荧光染料（Cy3、Cy5、Cy7）化学偶联，以产生一种新染料，该染料使用荧光能量转移 (FRET) 来增加每根激光可激发的荧光染料数。例如，Texas Red 的最大激发波长为 589 nm，PE 的发射波长为 585 nm，因此通过将 PE 耦合到 Texas Red，PE 的发射用于使用 FRET 激发 Texas Red，从而允许 PE-TxRed 能被488 nm 或 532/561 nm 激光激发。高分子聚合物染料使用相同的方法来增加可被单个激光激发的可用荧光染料种类。串联染料非常明亮，具有较大的Stokes位移值 (150–300 nm)，这在处理低抗原密度时非常有用。然而，串联染料不如供体荧光染料稳定，并且在能量转移效率方面可能因批次而异，从而使补偿复杂化。大多数较长的 Brilliant 聚合物染料也是串联染料并存在同样问题。

用于质谱流式细胞术的抗体与镧系元素系列中的单一同位素重金属离子结合。目前有 35 种镧系元素同位素可用于抗体偶联。这些探针是非荧光的，仅适用于质谱流式细胞术。一旦评估了其他金属元素与该平台的适用性，其他抗体偶联物也将可用。

荧光蛋白经常用作基因表达的报告系统。最常用的是来自维多利亚水母的绿色荧光蛋白（GFP）。GFP被克隆以产生青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。红色荧光蛋白 (DsRed) 是从蘑菇海葵中发现的，然后克隆用于蛋白质表达系统。下一代单体荧光蛋白（mCherry、mBanana）是从 DsRed 克隆的，具有更宽的激发和发射光谱。紫光和黄绿光激发的荧光蛋白在流式细胞术中的应用尤为广泛。新的荧光蛋白不断被发现和产生；目前存在数百种，激发和发射光谱范围从紫外到近红外。许多激光波长在现代流式细胞仪上的存在极大地扩展了荧光蛋白在流式细胞仪中的应用。

核酸染料结合 DNA、RNA 或两者。它们用于定量 DNA 以进行细胞周期分析（PI、7AAD、DyeCycle Violet、DAPI）、区分染色体以进行分选（Hoescht 33342、Chromomycin A3）、使用侧群SP分析（Hoescht 33342）分选干细胞、细胞活力和分选细菌等。它们可以与另一种标记物（如荧光染料结合的抗 BrdU抗体）结合来确定增殖。

细胞增殖可以通过掺入 BrdU（溴脱氧尿苷），然后用抗 BrdU 的抗体和 DNA 染料染色来测量。然而，这种方法不允许进行长期增殖研究。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 和其他类似染料可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。这些染料的红光和紫光激发变体现在也可用。每个细胞都被染料永久标记，由于染料的稀释，随后的细胞继承了较少量的染料。这些染料不影响细胞生长或形态，适用于长期增殖研究。

细胞活力可以通过排除染料（PI，DAPI）或通过染料与细胞内胺的结合来测定细胞膜是否完整，这些染料只适用于分析无需固定并立即分析的样本。胺结合染料，例如 Live/Dead 试剂 (ThermoFisher)、Zombie 染料 (Biolegend) 或 Fixable Viablity 染料 (BD Biosciences) 可以固定并适用于感染性细胞、需要对胞内抗原进行染色的细胞以及需要染色的细胞需要在获取之前存储的情况。

钙指示剂染料在与钙结合后会发生颜色变化。它们用于指示细胞激活和信号传导。数据表示为与结合和未结合钙的染料相关的两个波长的信号比率。最常用的染料仍然是 indo-1，一种紫外激发的双相钙探针。还有包括fluo-3 在内的蓝绿光激发的钙探针。