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单链Oligo合成与DNA组装技术

2021-4-8| 编辑: 归去来兮| 查看: 212| 评论: 0|来源: 分子生物应用 | 作者:biojeremy

摘要: 合成生物学作为迅速发展的交叉学科,已在生物医药、新材料、诊断、能源和数据储存等领域展现越来越广泛的应用潜力。合成基因组学作为合成生物学的重要研究方向,着重于新生命体系的从头设计与合成,其以Oligo(寡核 ...

合成生物学作为迅速发展的交叉学科,已在生物医药、新材料、诊断、能源和数据储存等领域展现越来越广泛的应用潜力。合成基因组学作为合成生物学的重要研究方向,着重于新生命体系的从头设计与合成,其以Oligo(寡核苷酸链)合成、拼装和转移等核心技术为支撑。新生命体系的从头设计与合成不仅需要合成组成基因组的小片段DNA片段,还需要通过后续的组装与拼接获取完整的合成基因组。Oligo合成及基因组DNA拼装、转移技术是合成基因组学乃至整个合成生物学领域的核心技术体系,今天主要来介绍体外单链DNA(Oligo)合成与双链DNA拼接组装技术。




1.  单链Oligo合成技术

Oligo即寡核苷酸链,分子实验室常用的PCR引物、NGS捕获探针、qPCR探针和FISH探针等都是Oligo。与双链DNA相比,Oligo有个一个共同的特点他们都是单链DNA序列,根据功能不同,可以在Oligo上修饰荧光基团、化学基团(如,羧基、氨基、巯基等,)等。根据合成原理,目前Oligo的合成方法可分为已经成熟并商业化的化学合成法和正在研发中的酶促合成法

1.1  化学法

Oligo的化学合成研究始于20世纪50年代,Michelson和Todd首次报道采用磷酸二酯法实现了寡聚二核苷酸的合成。到20世纪80年代,Beaucage和 Caruthers开发了基于亚磷酰胺的DNA合成方,即今天Oligo自动化生产所采用的主要方法。该方法包括去保护、偶联、加帽(可选)及氧化 4 个步骤 (图 1)。由于随着链延长所带来的化学反应效率、合成纯度以及产率的下降,目前该方法合成的Oligo长度一般不会超过200个核苷酸(nt)。为了提高通量,从20世 纪90年代开始发展起来的基于微阵列芯片的DNA合成策略,使得合成成本降低了若干个数量级。然而由于芯片特有的不均一性及边缘效应等原因,相较传统的柱法合成,芯片法合成在长度、准确性方面均有所下降。为了增加芯片合成的精确度,科学家采用不同的技术策略,从各异的芯片产物中挑选出正确合成的寡核苷酸原料。Kosuri采用了多重PCR策略,选择性扩增目的寡核苷酸片段,结合酶促纠错等方法,可以合成长度超过200 nt的寡核苷酸原料,实现了更大规模和更高精度的合成。

图 1.固相亚磷酰胺法从头合成寡聚核苷酸链的4步反应

4步反应包括:(1)去保护。酸催化去除 DMT(二甲氧基三苯基甲基)基团,以便下一轮碱基(dA、dC、dG和dT)添加。(2)碱基偶联。将含有DMT保护基团的亚磷酰胺通过四唑活化剂加到未保护的5′OH末端。(3)加帽。将游离的5′OH乙酰化,以防止进一步的链延伸所造成的单碱基缺失。(4)氧化。通过碘液将磷酸三酯氧化为磷酸盐,进入一个反应循环.



1.2  酶促从头合成法

目前亚磷酰胺法是商业化Oligo合成的主流方法,但其合成的长度限制在200nt左右,而且合成过程中亦会大量使用有毒化学试剂。由于在合成准确性及不需要使用毒性化合物等方面的潜在优势,酶促合成方法受到了越来越多的关注。与化学法相比,酶促法的作用条件温和,对DNA的损伤较少,有助于准确性的提高,同时减少了副产物的产生,可实现更长Oligo的合成。然而,酶促法的发展缓慢,至今未能实现商业化。根据Jensen和Davis对DNA酶促从头合成发展的总结,末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导的酶促合成法是较好的选择,但还需要更进一步优化。TdT介导的DNA合成技术开发中首先需要解决单个dNTP添加后的终止效率及末端重新活化的问题。近期,Palluk等提出了一种解决方案,他们将 dNTP通过可光诱导剪切的连接子与TdT连接,所得dNTP-TdT复合物可在10—20s的时间完成DNA链的延伸,而且可以重复进行,实现特定DNA链的合成。该方法将为具有实际应用价值的酶促DNA合成法的开发打下基础。







2. 双链DNA/基因合成技术


DNA合成技术是合成基因组学,乃至现代分子生物学的根基,受当前合成技术的限制,双链DNA/目标基因组只能以短链Oligo的形式逐步拼接才能获得。PCR(聚合酶链式反应)或者酶切方法只限于获得自然界已有的DNA片段,而双链DNA/基因组的从头合成则需要通过Oligo的拼接获得,所以,如何提高Oligo合成的长度和效率、降低合成成本是后续进行大规模基因组合成的关键突破点。体外双链DNA的拼接根据原理区别,分为以下几种技术。


2.1  Gibson 组装

Gibson组装最早由Gibson等在2009年提出,原理如图2所示。该技术基于5′核酸外切酶、DNA 聚合酶及连接酶,利用DNA片段的两端同源序列(其长度通常为1540bp),实现DNA组装。将这些DNA片段和3种酶的混合溶液孵育1h即可。5’外切酶,从5’端开始对DNA进行消化,产生长的黏性末端,这样便于与另外的同源末端进行配对结合;DNA聚合酶,用于修补由5’外切酶产生的缺口,在Gibson组装中用的是Phusion DNA聚合酶,当然,Taq DNA聚合酶也可以用;DNA连接酶,实现共价连接,形成完整的DNA分子。该方法的优势在于这3种酶都可以在同一个温度下发挥功能,可一步完成组装,组装后的质粒可直接用于转化感受态细胞,无需限制性内切酶,通常该方法可组装不超过6个片段。

2010 年,Gibson等科学家使用Gibson组装和酿酒酵母体内同源重组人工合成了1.08Mb的丝状支原体基因组并转入去核的山羊支原体,新移殖的细胞表现出了丝状支原体的性状。2016年,Hutchison 等人先用 PCR 合成一系列丝状支原体基因组片段,每个DNA片段长1.4 kb,然后每5个分成一组,再利用 Gibson 组装技术将5个一组的DNA片段连接成7 kb的单片段,最后组装成完整的基因组。作者只保留了必需基因,将1.08 Mb的基因组缩短到了含有473个基因的 531 kb。2017 年,Esvelt等人将Gibson组装技术与CRISPR/Cas9 技术结合构建了一个PAM质粒文库,用于评估鉴定来自不同物种的一系列不同的Cas9蛋白的活性。该方法在体外组装技术中应用广泛。


图2 基于5′核酸外切酶、DNA 聚合酶及连接酶的Gibson组装法

通过一步等温体外重组两个相邻的DNA片段(红色和蓝色,共用终端序列为黑色),两个DNA片段共价连接成同一个DNA分子。T5外切酶去除双链DNA分子的5’端核苷酸,产生粘性末端,互补单链DNA退火结合在一起,Phusion DNA聚合酶填充缺口,Taq DNA连接酶密封缺口。T5外切酶是不耐热的,在50℃培养期间失活,所以不会与DNA聚合酶竞争DNA模板。



2.2 Golden Gate组装

Golden Gate组装技术是基于非同源重组的代表性技术,其利用Ⅱ型限制性酶 BsaⅠ在识别位点外部切割的特性,设计特异的突出序列同时组装多个片段,且酶切和酶连可以同时进行,原理如图3所示。首先,扩增目的片段,在两端加上BsaⅠ识别序列,同时在识别序列内侧加上不同的4 nt突出部分,相邻片段衎接处的4 nt反向互补配对,然后将片段分别插入酶切前的中间载体,因此一共可以设计256个突出的末端。利用E.coli富集含有不同目的片段的中间载体,将这些载体与最终的载体(含有2个相邻的BsaⅠ酶切位点)混合,加入BsaⅠ和DNA连接酶,同时进行酶切和酶连组装多达9个DNA片段。

2011年,Cermak等人利用Golden Gate高效组装了TALEN敲除系统中的重复序列,整个过程只需要两步:第一步先将最多10个RVDs按顺序组装,每个RVDs可识别1个核苷酸;第二步再将这些RVDs和TALEN系统的其它功能元件如NLS、AD等组装成最终的敲除质粒。2015年,Lauressergues等人使用Golden Gate构建microRNAs表达质粒,探究了苜蓿、拟南芥中2条 microRNAs的转录调控作用及其它5条microRNAs编码的具有调控作用的短肽对植物主根生长的影响。

图3 基于Bsa I内切酶的Golden Gate组装




图3 Golden Gate组装





2.3 同尾酶BioBrick、iBrick 和 C-Brick

BioBrick是合成生物学领域一个经典的基因组装技术,BioBrick的原理如图4所示。同尾酶可以识别不同的DNA序列但是能切出相同黏性末端的一类限制性内切酶,但其切开的末端相互连接后不会再形成原酶切位点。其利用同尾酶Xba Ⅰ和 Spe Ⅰ酶切产生相同的粘性末端,酶连后片段连接处会产生86p的疤痕,Xba Ⅰ和Spe Ⅰ都不再识别连接处的疤痕,这样即可在不损失酶切位点的情况下不断组装DNA片段。2014年,国内学者利用归位内切酶I-Sce Ⅰ和PI-Psp Ⅰ可产生相同粘性末端的特点,模仿BioBrick原理设计出一种名为iBrick的DNA 组装方法。归位内切酶识别的序列比普通的限制性内切酶长,在DNA中出现的频 率极低,因此iBrick相比于BioBrick对DNA片段序列几乎没有限制。但较长的识别序列在酶切酶连组装的同时也产生了更长的疤痕,为了解决这个问题,科学家利用一种应用了CRISPR-Cas系统的DNA组装方法C-Brick。C-Brick利用Ⅴ型CRISPR/Cas 系统蛋白Cpf1核酸内切酶,在PAM位点切割产生5nt的粘性末端。该方法利用sgRNA识别长序列的特点避免了对待组装片段序列的要求,同时可灵活设计sgRNA以识别不同的序列,只产生5 bp的疤痕,完美地规避了 BioBrick 的缺点。

图4 BioBrick技术的组装原理






2.4 基于DNA聚合酶的策略。

该方法首先合成有互补配对重叠区的Oligo,利用PCR扩增的原理,可以对有互补重叠区的Oligo进行延伸连接获得小DNA片段,然后小DNA片段以重叠PCR的方式进行逐步连接获得目的DNA片段,以其作为模板,进一步PCR扩增可以大量获得目的片段(图5)。此方法(polymerase cycling assembly,PCA)无须依赖额外的DNA连接酶,直接从人工合成的Oligo开始组装,操作简单、快速。Stemmer 等人曾用此法实现基因及质粒的一步拼装。Smith等人则 通过增加 Taq 连接酶的步骤用此法合成了 ФX174 噬菌体 的基因组。

图5 基于DNA聚合酶合成法






3.  其他DNA组装技术

除了以上最常用的基因组装技术外,近年来发展起来很多其他DNA组装方法,如:SLIC、UNS、 PaperClip和 MASTER等方法。


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参考文献:

1.Daniel G Gibson,Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases;

2.卢俊南,DNA的合成、组装及转移技术;

3. Liang J,Twin-primer non-enzymatic DNA assembly: an efficient and accurate multi-part DNA assembly method.

4. Li MZ,Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.

5. Torella JP,Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.

6. Torella JP,Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.

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