来源：小桔灯网 作者：quite ISR是什么？
ISR是指用验证过的分析方法对试验样品进行再次分析，所测值与最初的测试结果比对，从而证实方法的可信度。ISR是生物分析领域最基本的概念，可用来考察药代动力学（PK）、生物等效性（B）和临床前安全性研究中所采用的生物分析方法的重现性和准确性。它可以作为一种有效的工具来评估用配制样品建立的方法是否适用于实际样品的分析。 为什么要引入ISR？
进行ISR的主要是因为配制的校正标样和真实研究样品之间存在差别，这种差别主要是由于真实样品经历了体内循环及代谢转化途径。美国食品药品管理局（FDA）引入ISR的必要性为尽管分析方法验证是可接受的（QC的RSD为6%），但 Cmax却有 30% ~ 80%的差别，重复测定值与原始值竟有高达350%的差异。已测样品稳定性（ISS）是另外一种监测分析物和代谢产物在储存期间稳定性的方式。ISS与ISR密切相关。ISR和ISS目前已成为生物分析不可缺少的一部分，本篇主要介绍下ISR。 ISR适用范围 EMEA《生物分析方法学确证》中指出，下列情况应进行ISR：所有关键的生物等效性试验、首次人体试验、首次患者试验、首次在肝及/或肾功能损伤患者中进行的试验。FDA《生物分析方法学指导原则》草案要求:对所有人体生物等效性试验及所有关键的药代（Pharmacokinetic，PK）或药效（Pharmacodynamic，PD）研究均应进行ISR。我国2015 版药典附录草案提出“对于人体试验样品，应该对每个受试者群体或患者群体进行已测样品评价，除非另外说明理由。对于人体生物等效性试验，应进行已测样品分析”。 ISR的样品选择 EMEA 《生物分析方法学确证》提出，< 1 000个样品的试验应分析10%的样品，> 1 000 个样品应分析5% 的样品。FDA《生物分析方法学指导原则》草案提出，ISR总体数量应为检测样品量的7%。我国2015版药典附录草案未对样品数量提出明确要求。但上述指南均建议，ISR应选择峰浓度（Cmax）附近和消除相的样品。EMEA和我国指南同时要求不应该合并样品，因为合并可能限制异常情况的发现。
Cayen应用统计原理分析指出，为探查系统误差/随机误差带来的检测结果差异，一般来说，重分析20个样品即足以探查分析结果20%~25%的差异，因此，ISR的样品量最少20个。对于一项研究，从10例受试者中每例抽取2个样品相对于完整的分析 1~2例受试者的所有样品得到的ISR结果更为严谨。 ISR接受的标准 EMEA《生物分析方法学确证》、FDA《生物分析方法学指导原则》草案及我国2015版药典附录草案均规定:两次测得值的差异对于至少67%的重复测试应在20%范围内。Hoffman等提出上述结果百分率的差异应以下述公式计算:（复测-初测）/初测值× 100% ;但EMEA和FDA指导原则规定差异的计算公式为:（复测-初测）/均值 × 100%。此外，在进行ISR前应有标准操作规程明确ISR的接受标准。 ISR不重现的原因分析 下面列出了会引起样品分析结果不重现的一种或多种可能的原因。 （1）原药或代谢产物在采集或贮藏的样品中不稳定，发生内部转化。 （2）由样品采集、转运和贮藏引起的样品不均一。 （3）实验中的人为错误，如标签错误，样品涡旋和融化不彻底，样品在采集、贮藏处理和分析过程中被污染。 （4）不同供样者样品中的药物蛋白质结合率不同。 （5）基质干扰，特别是在反相色谱中后洗脱的磷脂。 （6）回收率（RE）差异。 （7）存在典型的共同给药。 （8）药物赋形剂的影响。 （9）分析方法的稳健性不足。 （10）内标不能有效反映分析物液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）响应值的变化。 （11）所使用溶液、试剂和耗材的纯度不同。 （12）来自异构体的干扰。 降低 ISR失败率的解决方案 遵循相关法规，药物非临床研究质量管理规范（good laboratory practice，GLP），药物临床试验质量管理规范（good clinical practice，GCP），良好记录规范（good document practice，GDP）。有文献报道，在一个符合GLP的分析环境下，可以将错误最小化，减少ISR的失败，提高调查时的效率。所有相关调查都应被完整记录，关注问题产生的根源，设计解决问题的方法，避免问题再次发生；充分遵循和运用已有的法规和指南，例如GLP、GCP、GDP。 在方法开发之前，充分了解化合物特性，包括理化性质、光谱属性、稳定性、药物代谢和生物转化作用。了解化合物易转化或者同质量代谢物及其可能浓度，血浆蛋 白结合率，血浆和全血分配比，在不同 pH缓冲溶液中的稳定性和不同溶剂中的溶解度等。充分了解化合物在溶液以及基质中的短期（前处理过程中）和长期（储存及运输中）稳定性。在方法开发时，建议使用多个MRM离子对，采用不同的色谱条件和样品前处理方法考察是否有其他代谢产物或基质的影响；有文献采用梯度洗脱的方法使化合物的保留时间尽量远离由于基质导至的离子抑制或者增强区域，可有效解决基质效应。此外还可以采用同位素内标，减小进样体积，在液相色谱中使用较低的流速和改用不同的离子源等方法。而对于代谢物的影响，使用大气压化学电离，无活性的流动相，在冰浴中融化和进行样品前处理，采用缓冲溶液保持稳定pH，加入保护剂或者使用惰性溶剂可有效减小在仪器分析和样品处理时代谢物转变的影响。 尽管来自质控样品的稳定性数据可模拟化合物在真实样品中的稳定性状况，但在某些情况下，使用真实样品进行稳定性试验很有必要。使用空白基质并不总能反应该分析方法在试验样品中的表现，例如体内复杂的代谢物与酶的影响。尤其对于高难度 的方法开发，采用预实验获得的少量临床样品，很多问题可以在方法开发与验证时显露出来并解决，避免ISR的失败。虽然会花费额外的成本与时间，但是值得的。如果无法在预实验时获得人体样品，可以先获得动物样品，再将动物样品和采用体外试验获得的人体代谢物进行混合，尽量减小代谢上的种属差异。如发现可能存在稳定性问题，阶梯式选取时间点进行全血稳定性测试并观察其趋势。化合物在血浆与全血中的稳定性有时并不相似（约 5%），因此要保证样品采集过程中化合物的稳定存在，全血稳定性的考察十分必要。上述试验中得出的结论，以及ISR调查结果，样品采集过程中的预防措施，需要反馈给临床机构，并写入样品处理指南。 引用： [1] CAYEN MN．Early Drug Development: Strategies and Routes to First - in - Human Trials[M]．British: John Wiley & Sons Ltd，2010: 175 [2] European Medicines Agency. Guideline on bioanalytical method validation．Committee for medicinal products for human use [EB /OL].（2009）[2013-12-16]. http://www.ema.europa.eu /docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline /2011 /08 /WC500109686.pdf． [3] Food and Drug Administration. Draft Guidance for Industry: Bioanalytical method validation [EB/OL]. [2013-12-16]. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceCompliance RegulatoryInformation /Guidances/UCM368107.pdf. [4] 钟大放，李嵩，刘昌孝.生物样品定量分析方法指导原则（草案）[J]. 药物评价研究，2011，24（6）:409-415. [5] 张煊，闰东，高静，等．生物样品分析中的试验样品再分析研究进展[J]．药物分析杂志 ，2015，35（3）：383 [6] 李文魁，张杰，谢励成. 液相色谱-质谱（LC-MS）生物分析手册：最佳实践、实验方案及相关法规[M]. 北京：科学出版社. |
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