诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正）

目前最主流的核酸检测方法就是荧光定量PCR了（Realtime PCR或qPCR），本节以qPCR为例进行讲解，如何评价核酸检测方法。本章内容主要参照OIE《Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019》（以下简称“OIE”）；《兽用诊断制品试验研究技术指导原则》（以下简称“兽用诊断”）和《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》（以下简称“医学诊断”）。因为我们不是要申报试剂盒而是评价试剂盒，而评价工作需要结合每个实验室的实际情况，可繁可简，因此我会在每一项评价指标后列出这三种的要求，大家可以自己选择。由于每一项标准中的术语不太一致，我统一按照OIE的术语来进行分类。

1.重复性 Repeatability，也称为精密度Precision

小结：笔者认为针对qPCR试剂盒批内重复性评价，至少包含阴性，弱阳和中阳3个浓度的样品，每份样品至少重复3次，由不同人员，在不同时间进行实验；批间重复性可以参照批内重复性。根据医药标准YY/T 1182目前的评价指标为CV≤5%，笔者认为这个指标不适合评价qPCR的CT值，因为CV只适合评价拷贝数等正态分布的数据，而CT值是拷贝数取log获得，因此建议将CT值转化为拷贝数之后再进行CV值的评价。

2.再现性Reproducibility

小结：对于连锁实验室，评价试剂盒时可以选择三家不同实验室共同进行，这样可以避免单一实验室的系统误差。对于自建方法的实验室再现性评价必不可少，对于用成品试剂盒可做可不做。

3.分析敏感性Analytical sensitivity（ASe），也称最低检测限 limit of detection (LOD)或者灵敏度。

小结：分析敏感性的评估应该分2步进行，首先选择已知量值的模拟样品（DNA病毒为质粒或假病毒，RNA病毒为假病毒）或临床样品进行倍比稀释，每个浓度至少重复3遍，得到检测均为阳性的最低检测浓度。同时绘制标准曲线获得R^2和扩增效率的信息（一般要求标准曲线至少5个点，qPCR的R^2≥0.99，扩增效率在90%-110%）。接着在最低检测浓度附近制备若干浓度，20次重复，19次以上检测为阳性的浓度为该方法的分析敏感性/最低检测限。

4.分析特异性Analytical specificity（ASp），也称交叉反应Cross-reactivity。

小结：特异性检测除了需要检测可能存在交叉感染的其他病原外，还应对宿主DNA，内源性干扰物（甘油三酯、血红素、肝素等），外源干扰物（粪便、泥土、饲料、消毒剂）进行检测。

5.诊断敏感性Diagnosticsensitivity（DSe）

6.诊断特异性Diagnosticspecificity（DSp）

小结：诊断敏感性和特异性的评价是针对临床上确定感染和未感染样品的检测结果。但是在具体操作中如何确定一份样品是否阳性或阴性是个问题，可以使用金标方法，参考实验室确认或动物实验样品等。

样品数量可以参照上表，如果预期试剂盒的DSe和DSp为95%，允许5%的误差，90%的置信度下最少应为60份样品。

诊断敏感性和特异性统计分析使用2×2表

除了使用上表计算诊断敏感性，诊断特异性和符合率之外，多个试剂盒评价通常使用κ值。

7.与已有的国际或者国家标准方法或者利用标准物质对试剂进行评价。

目前像ASFV、FMDV和AIV等都有已发布的国际和国家标准方法，用户应该向各试剂厂家索要这些比对数据，必要时也可以自己进行比较试验。另外如果有国内外的标准物质也应该使用在试剂比对中，使比对结果更加准确可靠。