鲁炳怀：少见、罕见、新发病原体很难快速明确诊断，当呼吸道病原类型复杂难分，哪些快 ...

今天主要介绍呼吸道病毒快速检测技术的现状与发展方向。目前很难定义「快速检测」，是指「两个小时」以内拿到结果，还是需要「一天」的时间拿到结果？因为对于一些少见病原体、罕见病原体或者新发病原体来说，很难达到几个小时就能明确诊断，需要更复杂的技术、更长的时间才能确认。下面讲述的「快速检测」，指的是与传统的方法相比，得出结果更快的技术。

相关的内容，我可能在不同的场合也涉及过，非常荣幸再次与大家分享。

呼吸道与外界相通，环境中的病毒、细菌、真菌、寄生虫等可通过吸入方法，引起呼吸道感染，主要上下呼吸道感染。近几年对病毒的关注比较多，尤其是2019年底延续到现在的的新冠（COVID-19）疫情以来，大家对病毒引起呼吸道感染性疾病或者其他部位的传染性疾病尤为关注，例如引起呼吸道感染的流感病毒、腺病毒，曾引起院内感染的消化道病毒诺如病毒。此外，人体定植的病毒，如某些冠状病毒、鼻病毒、巨细胞病毒等，也可能引起呼吸道感染。正是因为呼吸道病原的类型比较复杂，引起的临床症状，与一些细菌感染、真菌感染临床上难以区分。这就需要一些采用实验室技术手段检测病原，明确病原类型，才能明确诊断，决定下一步的临床治疗。

2016年版CAP指南提到，我国成人CAP患者中病毒检出率为15%-34.9%，流感病毒占首位，其它病毒包括副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。病毒检测阳性患者中5.7%-65.7%可合并细菌或非典型性病原体感染。对于儿童而言，病毒中的呼吸道合胞病毒占比较大，非典型病原体中的肺炎支原体为主，所以作为儿科医院的检验科或者微生物检验室，针对这些特殊的病毒或者非典型病原体的检测也非常关键。

另外，想提醒大家一点，随着检测技术的提高，我们现在发现对于引起呼吸道感染的衣原体而言，肺炎衣原体感染的几率并不是很多，而鹦鹉热衣原体感染的比例有增高趋势，常常与鸟类的饲养史有关。对于衣原体而言，不应只单纯检测肺炎衣原体，新生儿，沙眼衣原体是非常重要的病原；对于经常接触禽类鸟类的呼吸道感染的患者，鹦鹉热衣原体成为很重要的病原。建议生产厂家要根据不同的流行病学谱和感染的主要病原类型来设计试剂，特别是多重检测试剂，临床实验室也应以此为依据选用相关的试剂。

上图所示，来源于一篇CRITICAL REVIEWS IN MICROBIOLOGY的综述（DOI: 10.1080/1040841X.2019.1681933），告诉我们目前临床微生物检测手段主要包括哪些。分子生物学方法、抗原检测方法是最常用的检测病毒的手段，在国外和国内的指南都有推荐。很多指南都不推荐采用快速抗体检测方法诊断呼吸道病原感染，比如腺病毒感染或者流感病毒感染，检测抗体，无论是IgM或IgG，单次检测，价值不是很大。抗原检测的主要特点是特异性良好，但灵敏度略差，在适宜采样的前提下，根据患者病毒载量的多少，灵敏度会在40%~70%，不同的文献报道具有一定差异。另外，有很多细菌侵犯人体后，降解产物进入血液，最终出现在我们的尿液中，然后可以通过尿液去检测相关的病原感染的情况。比如肺炎链球菌感染，检测尿液肺炎链球菌细菌壁的多糖成份（cell wall-associated polysaccharide），或军团菌（血清1型）感染的时候，检测军团菌尿抗原。肺炎链球菌尿抗原检测灵敏度50-80%，特异性在90%以上。重症感染时灵敏度会更高，但是如果病原载量不多的轻症感染或感染的不同阶段，灵敏度偏低。目前呼吸道病毒感染尚没有合适的尿抗原检测靶标，主要采集鼻咽拭子去检测抗原，包括流感病毒、腺病毒，或者冠状病毒。抗原检测适合病原载量比较高的情况下使用。

还有分子生物学方法，根据靶标的多少，PCR法可分为多重PCR或者单重PCR，未来的发展方向主要是多重PCR，至少是两重的。目前来说，针对两三个靶点设计产品，对于常规的分子试剂公司来没有多少问题。但是我们希望未来能够针对更多的病原，即拿到一份样本后，在短时间内针对多种病原靶标进行快速检测，实现「样本进，报告出」这样的「快速检测」模式，在两个小时以内完成10种、20种甚至更多的病原检测，我认为这是非常重要的发展方向。多重检测可以降低检测成本。当然，对于一些少见病原或者极为罕见的病原，实验室不可能针对这种病原专门设计试剂，从经济效益上讲不太合算。所以像这些情况，做宏基因组测序会更有价值。目前可以在一个体系里面加入几十种甚至几百种引物，先扩增，再测序，这就称为tNGS，这种方式的理论上讲灵敏度也很高，成本将来有可能降低，但还没有广泛应用于临床检测工作中。

提到分子生物学方法，我们总会想到PCR法、宏基因组测序等方法。实际上分子生物学方法现在已经多种多样了，比如恒温扩增技术、基因芯片等，只是这些应用相对来说比荧光定量PCR和宏基因组测序要少一些。近几年应用恒温扩增技术逐渐增多，PCR要有反复升温、降温的过程，对反应速度有影响，对于仪器设备要求也高。而恒温扩增去掉反复升降温的过程，使速度提高，但一般恒温扩增的灵敏度与特异度会低于PCR。还有美国的张锋教授发现的CRISPR技术，现在也慢慢应用到分子生物学检测的领域中，灵敏度很高，也许未来会成为分子生物学检测非常重要的一个方向。

对于传统微生物学方法，现在病毒培养方法应用的越来越少，在一些专门的科研机构和CDC部门需要活病毒开展研究工作时会使用。因为做病毒培养对实验室的硬件条件及人员防护要求更高，对于常规的一线的临床实验室，从人力成本和经济效益来看不好维持。后来慢慢过渡到免疫学方法，免疫学方法分为抗原检测和抗体检测。如前所述，抗体检测不太适合常规的呼吸道病毒检测与临床诊断，更适于回顾性分析。抗原检测简单易行，别有优势。分子生物学方法，根据DNA病毒或者RNA病毒去专门设计不同的引物进行相关的扩增。

这是国内近期发表的一篇文章。即采用抗原方法检测新型冠状病毒感染，欧美的一些国家很欢迎抗原检测方法，非常快速、操作简单，缺点是灵敏度偏低。我们没有用过这样的检测试剂，因为国内的阳性也比较少。可能在一些高发地区，抗原检测具有一定价值，可用于可疑人员的初筛。

为什么我们一直说用抗原检测不能够作为病毒感染阴性的确诊标准，就是因为灵敏度不够。比如患者的确是流感病毒感染、腺病毒感染或者呼吸道合胞病毒感染，但如果病原载量较低，或者是采样是咽拭子，没有采鼻咽拭子，或者采样的时候没有采到相应部位，本来应该从鼻腔进去，进去的程度要深一些，到鼻咽部的位置，实际中拭子进的较浅，采的是鼻拭子。或者病程较长。以上种种情况都会大大降低阳性率。所以，抗原检测结果如果是阴性，而患者的症状比较像，还是不能排除。建议用更灵敏的分子生物学检测方法。不同分子生物学检测方法的灵敏度还是存在一定差异，不同厂家之间差异比较大，所以我们建议实验室在使用某一种试剂之前要做好相应的评估。

在没有新冠病毒之前，我们特别关注每年的流感病毒。我们实验室每到秋冬季，每天都检出相当多的甲、乙型流感病毒。由于新冠疫情，大家开始佩戴口罩、采取个人防护等措施，2020年度-2021年初流感基本上已经「绝迹」了。可见控制新冠病毒的这种方式对于控制流感、控制呼吸道合胞病毒或腺病毒的感染流行都十分有效。

呼吸道合胞病毒（RSV）主要见于一些免疫力比较低下的老年人群和学龄前儿童。RSV占2岁以下儿童下呼吸道感染住院原因的42-45％，尤以新生儿及6个月内婴儿为易感人群。一般来说症状比较轻，以咳嗽、喘鸣等呼吸道症状为主，可引起间质性肺炎、毛细支气管炎等。如病情严重或反复发作，可发展为支气管哮喘，导至呼吸衰竭等。当RSV与其他呼吸道病毒合并感染时，可能引起严重后果。

这是一项横跨亚非两大洲七个国家的多中心研究，自1980年以来同类研究中规模最大、最全面的研究，发表在2019年《柳叶刀》杂志。在儿童人群中：其中呼吸道合胞病毒导至的肺炎占到了全部病例的31.1%，而细菌仅占27.3%，结核分枝杆菌占5.9%，其余为真菌和其他病原体。这一文献告诉我们RSV已经成为非常重要的一类感染的病毒，尤其是儿童群体。所以作为儿童医院，建议至少有一种检测呼吸道合胞病毒的方法，可采用抗原快检试剂，也可是分子生物学检测方法。我们不要把所有的精力都关注在新冠病毒上，实际上其他的病毒还是会给我们带来一定的影响。

呼吸道合胞病毒做抗原检测不一定很灵敏，有一部分人检测不出来，特别是病原载量比较低的时候，这时候建议采用核酸检测的方法。

上图所示，如果有些公司自己制备试剂的话，可以考虑甲型/乙型流感和呼吸道合胞病毒一起检测。

上图所示，除了常见的病毒，还可以纳入百日咳、衣原体、军团菌等进行多重快速病原学检测。检测结果与病原载量有关。如果病原载量比较多，常规的方法会得到阳性结果；但是如果病原载量非常少，如PCR检测的CT值在30个循环以上的话，这时候检测结果并不一定很准确，灵敏度可能下降，需要注意。

宏基因组测序在近几年应用较为广泛。在这次新冠病毒发现的过程中，有赖于宏基因组测序的使用。换句话说，我一直在强调对于少见病原、新发病原，或者从国外旅行回国感染的旅行相关感染，一般实验室很难针对这一类病原体设计检测方法，的确有赖于宏基因组测序。

实际上基因组测序不一定要做宏基因组测序。还有其他的方法，如上图所示，WGS主要是针对某一个分纯的菌落测序，检测其毒力特征、耐药特征、质粒分布、进化情况、同源性分析等。比如分枝杆菌，做药敏实验的话需要很长时间、需要特殊的条件，但是可以做WGS基因组测序，检测耐药基因，其耐药大多数都是通过点突变所致，和真实的药敏实验结果匹配良好。

还有tNGS，这是指有靶向的测序，先把需要检测的片段给扩增出来，然后再去测序。比如我只关心样本里面的细菌，就可以先把16s这个片段扩增出来，然后再去测序。若关心真菌的话，可以把ITS片段扩增出来，再去测序。还可以在这个体系里面加入我关心的数十种或上百种病原的引物，扩增后测序。这样的优点就是不用去测人基因组，降低成本，提高灵敏度。我们做mNGS的时候，实际上有相当一部分测序都耗费在人基因组上面。

上图所示，前段时间国内的科研人员在JCM发表的文章，他是做非结核分支杆菌的分类，先把很多个序列扩增出来以后再去测序，采用tNGS，也是非常重要的一个发展方向。

有一点想要提醒大家，我们做病毒检测并不是检测出来都有临床价值。如上图所示，有些病毒容易出现在无症状感染者体内，包括鼻病毒、部分冠状病毒等，但是流感病毒很少出现在无症状患者身上。解读结果，即要看病原的类型，还要关注临床的情况。

上图所示，这是前段时间中日呼吸中心总结的文章，发现呼吸道合胞病毒如果和甲流或乙流合并感染，患者的死亡率增加。这就告诉我们，临床检测的时候不能只关注一种病原，一种病毒感染以后引起另外一种细菌感染，比如肺炎链球菌或者金黄色葡萄球菌的感染，或者两种病毒同时感染，这种情况有可能发生。如果忽略另一种病原感染的话，可能治疗有失偏颇，会引起很严重的临床后果。

儿童和成人病毒感染均不容忽视，很多微生物的建设忽视了病毒感染这方面，免疫力低下人群的病毒性肺炎更应该引起我们关注。随着基因组测序技术的应用，病毒感染逐渐被大家认识了解。快速多重PCR检测是未来发展的重要方向，希望试剂公司能够了解临床需求。另外，宏基因组测序虽然在发展中，但是诊断新发病毒或罕见呼吸道病毒感染，多重感染，具有独特优势，我们应该认识到它的优点和缺点。不同的NGS测序会逐渐应用到更多的场景中，为临床医生提供更多的便利。

主持人王一民：对于床旁病原学快速检测（M-ROSE）技术来说，我理解的M-ROSE技术就是把显微镜放到床旁，标本快速在床旁镜检的技术，无论是通过传统的革兰氏染色法，还是再增加一些针对细胞学的瑞氏染色法，去看细胞和病菌之间的关系，去判断病原是致病、污染，还是定植，除了检测技术方面，在这些方面有没有提高？

鲁炳怀：M-ROSE技术是近几年比较热门的一项技术，在临床拿到样本后，及时快速对样本进行染色。最近我知道有些公司在做自动扫描，通过人工智能识别，把相应的细胞、病菌大致区分。我发现临床上大部分是在高倍镜下（400倍）看，实际上在高倍镜下看的话，只能看到一个大概印象，简单推测。临床微生物实验室习惯用油镜（1000倍）镜检。如果样本细菌或真菌数量很多，用高倍镜尚可；但是病原数量很少的时候，在高倍镜下仅可以推断。

未来主要的发展方向，快速多重PCR检测应该是一个非常重要的方向。比如患者是链球菌引起的非常重症的感染，有时候在镜下是看不到肺炎链球菌的，使用药物以后，链球菌已经消失了，但是它感染非常严重。M-ROSE、实验室的显微镜检，是灵敏度不高的快速检测手段。比如结核分枝杆菌，显微镜检出的阳性率不会超过30%。目前结核分枝杆菌检测更灵敏的是Xpert。我认为把快速诊断前移到床旁，患者马上取得样本，马上去检测，这是一个非常好的发展方向。第一，能够开展这样实验的话，表明临床对病原学检测这件事情非常重视；第二，有利于人工智能形态学的快速发展，有需求的时候可能才有这种发展，这样技术结合非常有前景。

主持人王一民：有些同道请教您有关核酸检测方面的问题。现在新冠病毒是因为我们可能考虑环境暴露和感染的风险，更多的是采集口咽拭子或鼻咽拭子。但是对于其他病原，可能采集痰液或者做肺泡灌洗液比较多。那么，对其他病原能不能也像新冠的核酸检测一样，能不能简单点，只采口咽拭子或鼻咽拭子？

鲁炳怀：对于很多呼吸道病毒来说，采鼻咽拭子是一种很好的方式。因为正常人相对来说很少有这些病毒（如流感病毒、腺病毒）的定植，在上呼吸道检测出来，大致可以推测患者有相关的感染。但是对于细菌和真菌完全不是这样，如鼻咽部可能有大量的金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌的定植，绝对不能够以上呼吸道鼻咽部采集的样本中含有细菌、真菌的情况来反映下呼吸道的感染。技术再好，采样是最重要前提，最好的采样方法就是离感染部位最近的位置采集样本，所以对于肺炎来说，即使是病毒感染，我也相信留取肺泡灌洗液会比鼻咽拭子检测灵敏度会更高。还有一个原因，现在做新冠病毒大多是筛查，而不是患者真正出现了肺部感染症状。对于多数的呼吸道病毒感染，如果有肺部的症状，鼻咽拭子可能也是阴性的，采肺泡灌洗液才是最佳的选择。举个例子，之前有位呼吸科大夫怀疑一位患者是结核感染，上午来就诊后，采集痰样本去做痰检，结果为阴性，下午刚好又做了肺泡灌洗液，结果为阳性。所以，越接近感染部位采集的样本，一定反映真实的感染的病原，绝对不能够说把新冠病毒采集核酸检测进行大面积人群普筛这种特殊情况推而广之。

* 感谢赛沛（上海）商贸有限公司 的大力支持

本文完

排版：Jerry