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循环肿瘤细胞检测技术分类,优点和局限性!

2021-1-9| 编辑: 小桔灯网| 查看: 315| 评论: 0|来源: 医健趋势

摘要: 循环肿瘤细胞(CTCs)是肿瘤细胞从原始或转移肿瘤组织上自然脱落后在血液中循环,并可导至新的转移。CTC检测是对抗癌症的关键工具,可用于早期诊断、治疗监测、复发监测和用药指导。Zheyu Shen等在权威杂志《Chemistyr ...


 

循环肿瘤细胞(CTCs)是肿瘤细胞从原始或转移肿瘤组织上自然脱落后在血液中循环,并可导至新的转移。CTC检测是对抗癌症的关键工具,可用于早期诊断、治疗监测、复发监测和用药指导。Zheyu Shen等在权威杂志《Chemistyr Society Reviews》(IF=42.846)上发表题为《Current detection technologies for circulating tumor cells》的文章,对目前报道的CTC检测技术进行了分类,总结了优点和局限性。

目前开发的CTC检测技术一般分为四个步骤:(1)捕获,(2)富集,(3)检测,(4)释放。捕获步骤是CTCs与材料(如物理相互作用和抗体/抗原相互作用)之间的特定相互作用,如磁珠,微流控芯片;富集步骤是指从血液中分离CTCs;富集后,CTCs可以通过荧光(如荧光显微镜,荧光分光度计和流式细胞仪)[1, 2]、表面增强拉曼散射(SERS)[3]或电阻抗[4]进行检测;CTCs释放后可进行进一步的表型鉴定和分子分析(如RNA分析和细胞代谢分析)。



当前CTC检测技术分类技术树


这些CTCs检测技术的重要技术指标包括回收率、纯度和检出限(LOD),见表1。回收率定义为富集CTCs在血液中占总CTCs的数量百分比,也称捕获效率或富集效率。纯度是指富集CTCs的数量占富集样品中细胞总数的百分比。LOD是可检测到血液中CTCs的最低浓度。



01

不富集的CTC技术


 没有富集步骤的CTCs检测也称为直接检测,包括扫描共聚焦显微镜和表面增强拉曼散射(SERS)技术。


共聚焦显微镜技术


共聚焦显微镜技术是一种快速、自动化的高通量筛选方法,基于微流体和多波长扫描共焦探测技术而开发[5]。血液中的细胞首先同时标记多个抗体,这些抗体与不同的荧光剂结合。血液通过微流控通道被泵出,用共聚焦显微镜扫描,根据荧光信号和标记方法,可以自动计数和报告CTCs的数量。

特点:(1)由于微流控通道中的流速有限,每个样本的检测时间太长(分析7.5mL的血液需要3.5h左右);(2)假阴性率达到40%以上;(3)由于需要几种荧光染料结合抗体来标记血液中的细胞,导至样品的检测成本较高;(4)不能分离CTCs进行下游表型鉴定和分子分析。


SERS直接检测


SERS是另一种快速分析外周血中CTCs的方法,它是基于具有靶向配体的高度特异性和敏感的SERS活性纳米颗粒来识别健康血细胞中的CTCs。首先将外周血样本添加到外周血淋巴细胞分离介质中,然后在室温下离心。含有白细胞(WBCs)和CTCs的低密度细胞层被转移到新的管中,与SERS活性纳米粒子孵育,并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤,最后利用拉曼系统对样品的SERS光谱进行分析[6, 7]。

特点是:(1)CTC检测过程不易自动化;(2)需要配体来捕获血液中的CTCs,检测试剂成本高;(3)不能分离CTCs进行下游表型鉴定和分子分析。


02

需要富集的CTC技术


血液中低浓度的CTCs可以通过两种不同的方式富集。一种是阴性富集,捕获非目标细胞和洗脱靶细胞;另一种方法是阳性富集,捕获CTCs并洗脱健康血细胞。


阴性富集


Lara等首次开发了一种阴性富集技术来获取血液中的稀有细胞,富集过程包括红细胞裂解、CD45抗体筛选白细胞、流过系统进行免疫磁选,最后使用自动细胞计数、过滤和视觉计数或细胞螺旋分析进行细胞分析过程[8]。为了提高CTC负富集的效率,Hyun[9]等开发了一种几何活化表面相互作用(GASI)的微流控芯片,利用人字形有效地捕获大量血液细胞(3a)。通道为人字形结构,可产生横向流动,促进细胞上的抗原与通道表面的抗体之间的有效接触(3b和c)。这是第一次尝试用负富集微流控芯片从转移性癌症患者中富集CTCs。该GASI芯片成功地富集了CTCs,同样的方法可能有助于收集其他类型的循环稀有细胞,其表型尚不清楚。在1毫升血液中,分离的CTCs的数量从1到51不等。

阴性富集CTC检测技术特点包括:(1)不依赖于CTCs的生物标志物表达(如EpCAM);(2)可收集完整的CTCs,可进行细胞和分子分析等下游研究;(3)易于自动化。 


阳性富集


阳性富集捕获CTCs并洗脱健康血细胞,分为体内富集和体外富集。

  • 体内富集

在体内,CTCs的正富集捕获和丰富了大量的稀有CTCs。Galanzha等[10]提出一种在小鼠血流中磁捕获CTCs的方法,然后进行快速光声检测。该方法通过整合体内多重靶向、磁富集、信号放大和多色识别,使CTCs能够从荷瘤小鼠血管中的大量血液中浓缩,这可能为癌症的早期诊断和预防人类转移显示出潜力。



体内富集在CTC检测特点是:(1)富集时间非常长;(2)技术不成熟,没有关于CTC纯度的数据报告;(3)成本很高:CTC捕获需要抗体。

  • 体外富集

1、不需要配体捕获。在没有特定配体结合的体外CTC检测被称为“物理捕获”,主要依赖于CTCs的物理性质(细胞密度、细胞大小和纳米棒表面)来捕获。优点是:(1)不依赖于CTCs的生物标志物表达(如EpCAM);(2)富集到的CTCs是完整的;(3)富集时间短,并可用于下游分析;(4)成本低。缺点是:这些技术的商业化难度大,富集得到的CTCs纯度低。

2、与配体捕获。

2.1 单一方式富集。指只有以下具有配体捕获的富集技术之一用于CTCs检测:密度梯度沉降、尺寸排除过滤、条形码颗粒、自行式微机械、磁珠和微流控芯片。

(1)密度梯度沉淀:配体被结合到具有高密度的微球表面以捕获CTCs,通过选择性沉淀,有效地从健康血细胞中分离出微球-CTC复合物。特点是:1)配体的使用增加了检测成本;2)微珠可能会影响光散射、猝灭,从而干扰荧光检测;3)微珠可能被内化到CTCs中,从而影响CTCs的活性;4)与微珠-CTC复合物混合的游离微珠会干扰CTCs的精确检测和分析。

(2)磁珠:配体被结合到磁珠表面以捕获CTCs,通过外部磁场将磁珠-CTC复合物与健康血细胞分离,这是一种相对成熟的技术。特点是:1)检测成本高;2)微珠的内化可能影响CTC的可行性;3)依赖CTC标记的表达,如EpCAM;4)整个过程(CTC捕获、富集和检测)不容易自动化。

(3)微流控芯片:微流控可在极小尺寸上达到精确控制。从患者中提取的血液样本量很小,配体被接到微流控芯片上,以捕获流动血液中的CTCs,从而从健康血细胞中分离出CTCs。

基于配体捕获的微流控芯片有许多不同的种类,其主要区别在于微芯片的设计,包括通道结构和衬底涂层。Nagrath等开发了一种独特的微流控芯片,用于CTC的富集,该芯片由一系列具有抗EpCAM抗体功能化的微柱组成[11]。决定CTC芯片上细胞捕获效率的两个基本参数是:1)流速:因为它影响细胞-微柱接触的持续时间;2)剪切力:必须足够低,以确保最大的细胞-微柱附着。在精确控制的层流条件下,微流控芯片在116个(99%)样品中的115个中成功地鉴定了癌症患者外周血中的CTCs,其范围为每毫升5-1281个CTCs,纯度约为50。

微流控芯片富集特点是:1)处理样本量有限;2)CTC富集时间长;3)剪切力必须足够低,以确保最大的细胞基底附着。

2.2 双模态富集

为了提高血液样品中CTC的富集效率,上述六种富集技术中的两种可以结合在一起。组合富集技术被称为双模态富集,如密度梯度沉降加尺寸排除过滤。然而,该技术尚不成熟,尚未得到广泛的研究。


03

总结


CTCs检测是对抗癌症的关键工具,在癌症早期诊断、治疗监测、复发监测和用药指导中起着关键性作用。“稀有性”是CTCs检测最大的难点,如何从几亿个血细胞中精准捕获几个CTCs细胞?富集效率极为重要。目前市场上CTCs的检测技术较多,阴性富集技术是公认富集效率最高,应用最普遍的方法。不依赖CTCs大小、理化性质及表面标志物,可将所有类型CTCs细胞一网打尽。


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参考文献

 [1] Xiong K, Wei W, Jin Y, et al. Biomimetic Immuno-Magnetosomes for High-Performance Enrichment of Circulating Tumor Cells[J]. Advanced Materials,2016,28(36):7929-7935.

 [2] Lu N, Xie M, Wang J, et al. Biotin-Triggered Decomposable Immunomagnetic Beads for Capture and Release of Circulating Tumor Cells[J]. ACS Applied Materials & Interfaces,2015,7(16):8817-8826.

 [3] Sha M Y, Xu H, Natan M J, et al. Surface-Enhanced Raman Scattering Tags for Rapid and Homogeneous Detection of Circulating Tumor Cells in the Presence of Human Whole Blood[J]. Journal of the American Chemical Society,2008,130(51):17214-17215.

 [4] Han S I, Han K H. Electrical Detection Method for Circulating Tumor Cells Using Graphene Nanoplates[J]. Anal Chem,2015,87(20):10585-10592.

 [5] Schiro P G, Zhao M, Kuo J S, et al. Sensitive and High-Throughput Isolation of Rare Cells from Peripheral Blood with Ensemble-Decision Aliquot Ranking[J]. Angewandte Chemie International Edition,2012,51(19):4618-4622.

 [6] Wang X, Qian X, Beitler J J, et al. Detection of Circulating Tumor Cells in Human Peripheral Blood Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles[J]. Cancer Research,2011,71(5):1526-1532.

 [7] Wu X, Luo L, Yang S, et al. Improved SERS Nanoparticles for Direct Detection of Circulating Tumor Cells in the Blood[J]. ACS Applied Materials & Interfaces,2015,7(18):9965-9971.

 [8] Lara O, Tong X, Zborowski M, et al. Enrichment of rare cancer cells through depletion of normal cells using density and flow-through, immunomagnetic cell separation[J]. Experimental Hematology,2004,32(10):891-904.

 [9] Hyun K, Lee T Y, Jung H. Negative Enrichment of Circulating Tumor Cells Using a Geometrically Activated Surface Interaction Chip[J]. Analytical Chemistry,2013,85(9):4439-4445.

[10] Galanzha E I, Shashkov E V, Kelly T, et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells[J]. Nature Nanotechnology,2009,4(12):855-860.

[11] Nagrath S, Sequist L V, Maheswaran S, et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J]. Nature,2007,450(7173):1235-1239.


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