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Nature综述:未培养微生物的新兴培养技术

2021-1-3| 编辑: 小桔灯网| 查看: 295| 评论: 0|来源: 微生态笔记 丨作者DengLab

摘要: 摘要尽管近年来微生物基因组数据激增,但通过基于培养的实验对于证实细胞生物学、生态作用和微生物进化的推论仍然十分重要。目前绝大多数古菌和细菌仍难以培养且对其特性了解不够充分,因此研究者们对高效的培养学方 ...

摘要


尽管近年来微生物基因组数据激增,但通过基于培养的实验对于证实细胞生物学、生态作用和微生物进化的推论仍然十分重要。目前绝大多数古菌和细菌仍难以培养且对其特性了解不够充分,因此研究者们对高效的培养学方法愈加重视,这也加快了许多方法学和技术的发展。本综述讨论了可能阻碍新型微生物的分离和培养的常见障碍,并介绍了具有针对性或高通量培养的新兴技术。此外,还重点介绍了成功培养新型古细菌和细菌的最新实例,并提出了未来可尝试培养的关键微生物。



编译:鞠志成

英文标题:

Innovations to culturing the uncultured microbial majority.

中文标题:

针对绝大部分未培养微生物的新兴培养技术

期刊:

Nature Reviews Microbiology,2020

第一作者:

William H. Lewis

通讯作者:

Thijs J. G. Ettema

作者单位:

荷兰瓦格宁根大学微生物学实验室



前言

基因组测序技术、复杂的宏基因组学及系统发育学的进步极大地改变了我们对微生物生命多样性的理解,其中就包括对“生命之树”形状的描绘。但目前对于古细菌和细菌的了解,要么来自少数经过精心研究的培养谱系,要么来自于未培养谱系的重建基因组。因此对一些新颖谱系的代表微生物进行纯培养十分必要,并至少具有以下三点意义:

  • 通过对纯菌或纯培养物进行连续的、可重复的实验,从而提高研究的可重复性和统计可信度;

  • 证明基于基因组的细胞生物学和生理学预测,解析其生长特性、代谢、生理等微生物特征,通过微生物富集或代谢物的研究有助于发现全新的酶促反应及通路;

  • 为所获得的宏基因组、转录组和蛋白质组学数据提供参考和有力的支撑,进一步解释微生物在自然环境中的基因的功能性表达和适应等问题。


正文

01


经典培养方法

微生物培养起源于19世纪中叶,许多现代的富集分离方法都借鉴了一个多世纪以前引入的某些原理,其中许多依赖于直接观察培养物的生理行为以及所含微生物的表型和基因型特征Fig 1)。灵活运用这些方法不仅需要消耗大量的时间和耐心,还很大程度依赖于研究人员的经验判断。


Figure 1.  常见的传统微生物纯培养方法



02


解释“The uncultured majority

“生命之树”是生物学中最重要的概念之一,在过去的几十年中已得到了广泛的扩展,其中包括几个具有较高分类学等级的古细菌和细菌。通常把生命之树中的原核生物分为两个域,即古细菌域和细菌域。据估计它们共包含数百至数千个门,随着基因组数据的积累,这一数字仍在不断增加(尽管估算方法可能不同)。根据16S rRNA基因序列数据,已计算出古菌和细菌的总数约为400,000个,包括约60,000个属,尽管其实际数量可能超出估算值几个数量级。然而只有约14000古细菌和细菌物种(分布在3500属和38个门)已被培育和有效描述。在这些物种中,约97%仅属于四个细菌门(拟杆菌门,变形菌门,厚壁菌门和放线菌门)Fig 2)。相反,所有其他细菌门以及整个古菌都由相对较少的纯培养物种所代表(Fig 2、3)


Figure 2.  已培养细菌主要是拟杆菌门、变形杆菌门、厚壁菌门和放线菌门

从每个物种总共15种核糖体蛋白的至少5种的串联比对中,推断出细菌的系统发育树,根据基因组分类数据库获得的1,541个细菌基因组进行编码。彩色圆圈中的白色数字是每个折叠的进化枝中各个分类单元的数目,也用于将相应的分类单元名称连接到进化枝。基于BacDive数据库中存在的分配给每个进化枝的物种类型菌株的数量,分类单元名称旁边的白圈黑字表示针对这些分类单元描述的培养分离株的物种数(数据收集截止2020.4.6)。



Figure 3.  古细菌的多样性主要由未培养的群体主导

从每个物种总共15种核糖体蛋白的至少5种的串联比对中,推断出古细菌的系统发生树,由从基因组分类数据库获得的1,166种古细菌基因组编码。彩色圆圈中白色数字表示每个折叠的进化枝中各个分类单元的数目,也用于将相应的分类单元名称连接到进化枝。基于BacDive数据库中分配给每个进化枝的物种类型菌株的数量,分类单元名称旁边的白圈黑字表示针对这些分类单元描述的培养分离株的物种数。



03


影响可培养性的因素

限制微生物可培养的因素有很多,主要包括底物和生长条件、休眠复苏、共生的相互依赖、物理接触或空间接近、环境理化条件、低丰度和竞争等。作者在原文中对这些影响因素做了较为详细的阐述,由于不是文章介绍的重点,在此不再赘述,下面详细介绍微生物培养学的创新方法和技术。



04


新兴培养技术

目前,提高目标微生物分离率的方法大多遵循两种策略(Fig 4)。一种是依靠扩大细胞分离的数量来增加分离感兴趣物种的机会(高通量分离和培养);另一种是,旨在有选择地分离具有特定功能特征或属于特定分类组的生物(目标隔离)。以下各节介绍了属于这两种类别的方法(Fig 5)


Fig 4 使用高通量或靶向分离方法用于培养微生物的工作流程

a|基于序列的栖息地筛选可用于识别目标生物相对丰度高的位置,然后从这些位置收集细胞样品。b |高通量方法可以通过用单个细胞接种培养基以建立大量单培养物,孵育培养物然后筛选其生长,然后筛选可行的培养物中的目标物种来实现。c | 靶向方法依赖于分离属于特定分类或功能组的细胞。d |培养分离株可用于下游表征和实验,以研究其生物学特性。



Fig 5 分离和培养新型微生物的技术创新

基于膜扩散的培养方法(绿色)如iChip、中空纤维膜腔(HFMC)、扩散的生物反应器或土壤基质膜系统(SSMS),即通过渗透膜让营养物质和代谢物扩散到培养基中,从而在培养过程中尽可能模拟自然条件。基于微流控培养方法(蓝色),例如纳米多孔微生物孵化器(NMMI)或SlipChip,是能够操纵以小体积和大量复制的细胞中,并且可以与各种液滴培养方法组合。基于细胞的分选的方法(黄色),如拉曼激活细胞分选(RACS)、基于活细胞(live-FISH)的荧光原位杂交或反向基因组学,提供了一种方式来分选定位具有特定功能或类别的细胞子集。


  • 膜扩散培养

      该方法可尽可能保留自然生境的必需生长因子,且膜孔径小到足以使生长因子而非细胞扩散,细胞可从环境或共生微生物中获得基本生长因子,同时可独立复制,形成理想的培养物或菌落。此外,微生物产生的潜在生长抑制代谢产物可以自由地扩散开,而不是局部地累积。以这种方式模仿环境原位生长条件,减少了培养基成分配制的繁琐步骤,特别是避免了传统培养基通常提供的过多养分。


  • 微流控培养系统

      微流控系统被广泛应用于各种生物学研究,此处以SlipChip培养为例介绍。其微隔室由两个相邻的腔室组成,当单细胞在其中分裂为两个细胞后,通过“滑板”将细胞分开,其中一个腔室的复制微生物可以进行生长和/或生物分类鉴定(通常具有破坏性),另一个则保留活细胞继续培养。这些系统的好处包括通过实验装置最小化来提高可扩展性并实现高通量、可以扩展到厌氧微生物的培养、也可以使用多个SlipChips并行筛选一系列不同的生长条件,表明该物种在特定条件下的生长。

      此外,由于许多微生物需要依靠其他微生物的产物生长,而基于单个密闭腔室的微流控芯片在此情况下不适用,所以结合了基于微流控和膜扩散技术的纳米孔微生物培养箱系统在2016年被开发出来,可渗透的腔室壁能够促进生长因子和信号传导化合物在所有细胞之间的转移,尽管该系统具有强大的应用潜力,但目前尚无公开的研究实例。


  • 通过分选和功能类群来分离细胞

      从混合群落的细胞悬液中分离单个细胞有多种方法,有高通量的技术例如基于液滴的分拣器和基于微流控的分拣器,目前已有成熟的市场化产品,也有高精度低通量的技术如基于显微镜的光镊子,该方法对细胞的损伤较小,且易于分离到稀有物种。

    FISH是一种广泛使用的荧光标记法,可用于鉴定和量化给定样品中属于特定分类组的细胞。由于大多FISH标记的细胞样品无法维持细胞活力,因此用于荧光激活细胞分选(FACS)进行分选时,研究目标通常是基于测序。尽管最新的Live-FISH技术能尽可能保持细胞活力,但实际研究中细胞存活率仍然相对较低,基于现有技术,FISH很可能不适合分离低丰度微生物。

    逆向基因组学方法能够在保持细胞活力的同时进行特异性的细胞标记,首先从环境样品中重建未培养微生物的近乎完整的基因组序列,然后在计算机上预测仅在靶标微生物中具有保守且暴露于胞外的膜蛋白,并将其用作抗体生产的表位,然后对其进行荧光标记。如果选择的表位与其他微生物的序列保守性较低,则标记应为分类单元特异性,最后通过FACS与剩余样品分离。



Fig 6 逆向基因组学用于新型微生物的靶向分离和培养的步骤


此外,还可以通过基于拉曼光谱的自动化分析平台,用于按功能属性对活细胞进行分类。首先将细胞在氘(D2O)存在下,在可能有利于目标微生物活性的生长条件下孵育。将氘按比例掺入更多活性细胞的合成脂质中赋予化学标记,然后可以在微流控装置中使用拉曼显微术检测氘标记,捕获相应的细胞并立即用光镊进行分类。它提供了一种替代基于荧光的标记分离的方法,同时选择了在某些条件下最活跃的细胞,从而对应于特定的生态功能。

 

  • 几种筛选方法

       在分离培养中,许多微生物菌株在固体培养基上生长缓慢且只形成微小菌落,因此借助菌落拾取机器人可以提高分类学筛选和重新接种菌落的速率和精度。

      光谱仪板读数器可用于对多孔板的单独孔中的液体样品进行光密度测量,但是,此方法可能不适用于每细胞密度低或仅增长到低种群密度的物种,也不能提供液体样品中存在的细胞数量的准确指示。另一种更敏感的方法是自动化的流式细胞仪,可用于有效地筛选生长,并从低至数十微升的培养物中定量细胞数量。

      基于PCR和扩增子测序对于感兴趣的目标物种是一种有效且可扩展的筛选方法,无法提供绝对丰度或总细胞数量,因此可以将测序数据可以与产生的细胞计数数据(如流式细胞术)相互补充。最近开发了一种经济实用的平台,可通过测序技术和微流控技术来自动DNA提取和全基因组测序,以并行筛选大量样品。该平台还可获取低生物量样品的高质量基因组数据,使其适用于筛选在培养物中生长至低种群密度或在固体培养基上形成微菌落的分离株。

      MALDI-TOF质谱法是分类学鉴定的另一种方法,该方法无需考虑培养基的组成和抑制剂的存在,并已被证明既快速又经济高效,可用于鉴定分离株,同时过滤出同种和非目标类群。目前,这些系统主要用于从临床或食品相关环境中鉴定微生物,其数据库不适合从其他环境中鉴定分类单元以及新型分离物。

 

总之,这些先进的培养技术亟待进一步发展和成熟,本综述中讨论的创新方法可能较好地代表了未来培养技术的发展方向。



05


局限性

尽管以上讨论的技术都具有提高微生物分离培养的潜力,从理论上讲,这些方法可以应用于多种分类单元,但在实际应用中可能更具挑战性。以下列出了目前方法的一些局限性:

1)    形成生物膜的微生物可能更难以分离以进行细胞分选和培养;

2)    样本中含有的非生物颗粒(如泥沙等)会干扰实验分析的准确度,而为排除实验干扰需要的步骤通常较为繁琐;

3)    新技术所使用的设备很难在典型的厌氧腔室中安装和操作;

4)    高通量培养方法的另一个困难是气态底物如H2、CO 2、CO、 CH4等的供应

5)    由培养温度导至的微小腔室的液体蒸发或蒸干会直接影响细胞生长,也会干扰自动光密度测量来监测生长情况;

6)    微生物的分离只是两部分难题的第一部分,另一难题是,必须找到合适的培养基和理化条件,以使分离得到的单细胞持续健康地生长。目前已有公开的策略和工具通过宏基因组的表型特征(并由蛋白质组和转录组数据进行补充)用于估算微生物的生理和生态特性,但仍缺乏足够的全面的数据信息和准确性;

7)方法理论可行和实验操作失败,可能归因于存在目前仍难以理解的生物学过程(如微生物休眠等),也可能是由于技术本身发展的不成熟。



06



近期成功培养案例


近年来,在微生物纯培养上取得了许多重要成就,其中一些报道已引起了多个领域的广泛关注。在古细菌中,一个显着的例子是Asgard古细菌的第一个代表,“ Candidatus Prometheoarchaeum syntrophicum”,它代表了迄今为止培养的真核生物中与古细菌亲缘关系最近的微生物,在包含两个物种的共培养物中高度丰富。在长达12年的时间中,使用了创新的生物反应器系统和传统浓缩方法,实现成功的纯培养,部分原因是这种生物的生长速度极慢。Nanohaloarchaeotaphylum中第一个代表微生物‘Candidatus Nanohaloarchaeum anoantarcticus’最近与广古菌门宿主Halorubrum lacusprofundi共同培养,并根据荧光原位杂交(FISH)实验推断,然后结合经典的富集方法和选择适当大小细胞的单细胞分选方法进行纯培养。“Candidatus Argoarchaeum  ethanivorans”和“Candidatus Ethanoperedens thermophilum”这两种古菌属于密切相关的属,它们是最早被证明与硫酸盐还原菌共养作用中氧化乙烷的微生物,已使用传统的选择性富集方法成功进行培养。类似的例子近年来还有许多,此处不一一列举。



07


未来可重点关注微生物

未来培养重心可根据研究人员自身的兴趣和目标倾斜。表1列出了一些值得关注的微生物类群,可以根据推测的功能和/或生态特性提高培养的概率,或是由于迄今为止没有代表性的纯培养微生物,因此有必要对其进行优先纯培养。

 

表一 重点培养目标

目标微生物或类群

常见生境

总门(Superphylum)和门 (Phylum)

兴趣点

古细菌

Anaerobic  methanotroph clades 1, 2 and 3

沉积物

广古菌门(Euryarchaeota)

它们是温室气体重要的汇。当甲烷从海洋沉积物下的甲烷储层中渗出时,可被它们代谢利用。因此有助于限制释放到大气中的甲烷量,并且是已知的唯一能够在厌氧条件下氧化甲烷的微生物。

Bathyarchaeota

沉积物

TACK古细菌

它们是一群全球分布的、在缺氧沉积物中含量丰富的、具有广谱代谢能力的微生物,包含来自广古菌门之外的一些已知的潜在产甲烷菌谱系。

Verstraetearchaeota

沉积物

TACK古细菌

广古菌门以外的少数几种已知的产甲烷菌属于该门。

Candidate

phyla Heimdallarchaeota, Helarchaeota, Lokiarchaeota, Odinaracheota and  Thorarchaeota

海洋沉积物和热泉口

候选阿斯加德古菌(Asgard archaea)总门

这些古菌属于阿斯加德总门,对于了解真核生物的起源非常重要。Heimdallarchaeota是目前真核生物中公认的姊妹系,因此是最重要的培养目标,在一些海洋沉积物中也有丰富的谱系。

DPANN  archaea

多种环境

DPANN古细菌

它们是一个主要的古细菌群体,目前被认为由至少12个不同的门组成,其中有6个已培养的代表微生物。通常其细胞和基因组较小,代谢能力有限,很可能是其他微生物的共生或寄生体。

海洋古生菌类群II, III and IV

海洋

广古菌门  (Euryarchaeota)

II类在某些海洋环境中含量丰富,被认为对于有机碳的降解很重要。III IV在某些海洋环境中数量众多,分布广泛,目前尚无任何此类进化枝的纯培养代表。

Water column B Thaumarchaeota

海洋

奇古菌(Thaumarchaeota

它们通过参与海洋深层的碳和氮循环并在生物地球化学中发挥关键作用。

细菌

酸杆菌门(Acidobacteria

土壤

酸杆菌门(Acidobacteria

它们是通用异养生物的广泛丰富的门类,被认为对某些陆地环境的生态有重要影响。

Candidate phylum  Rokubacteria

土壤

Candidate  phylum Rokubacteria

它们是新型的门,具有不寻常的小细胞大小,但基因组很大,并且广泛分布于陆地生态系统中。

Candidatus  Actinomarinidae

海洋

放线菌门(OM1)

放线菌属中没有培养代表的一类,它们具有简化的基因组、超小细胞大小,并且是假定的光异养生物,因为它们的基因组编码视紫红质的基因。

Candidatus Atribacteria

沉积物

Candidate  phylum Atribacteria (OP9/JS1)

它们在全球广泛分布,并在某些环境数量丰富,其包含厌氧烃降解和共养的丙酸氧化的物种。

Candidatus  Dormibacteraeota and Candidatus Eremiobacteraeota

土壤

Candidate phylum AD3  and Candidate phylum WPS-2, respectively

这些新颖的门所包含的物种被认为可在消耗痕量大气后存活。它们的纯培养可为贫营养土壤中含量丰富细菌的生长策略提供更广泛的认识。

Candidatus  Marinimicrobia

海洋

Candidate phylum marine group A

它们是一个丰富且高度多样化的群体,参与硫和氮循环,推动了海洋的生物地球化学循环,并且还可能充当温室气体N2O的潜在汇区。

Candidatus  Poribacteria

海洋

Candidate phylum  Poribacteria

它们通常是与海洋海绵相关的微生物群落的主要并广泛分布类群。

Candidatus Udaeobacter copiosus’

土壤

Verrucomicrobia

它们是具有高效代谢能力的异养生物,具有非常小的基因组,在许多土壤中普遍存在且丰富。

脱卤细菌

多种环境

绿弯菌门、厚壁菌门和其他门

其中某些物种能降解常见环境污染物,可用于生物修复。

CL500-11

水体

绿弯菌门(Chloroflexi

在深/淡水湖泊的低温层中,该进化枝的类群在全球范围内广泛分布。

SAR202

海洋

绿弯菌门

它们在中层和深海海洋中丰富,通常认为它们在硫循环中起主要作用。

Most wanted taxa from  the Human Microbiome Project

人体

多种门

这些细菌是根据119OTU识别的细菌,这些细菌由于其距已鉴定菌株的进化距离以及它们在健康人源样本中的频率而被优先考虑。培养此类微生物对于更好地了解人类健康和疾病至关重要

SAR324

海洋

Deltaproteobacteria

它们在代谢上具有多样性,并且遍及整个海洋的深层区。

SAR86

海洋

 Gammaproteobacteria

它们在海洋表层丰富,并在全球广泛分布。

Most wanted taxa in  soil

土壤

多种门

这些细菌被认为对于准确预测全球环境变化的生态后果至关重要,也有助于更好地了解土壤细菌群落。这些细菌在全球范围存在最为普遍且数量丰度,包括α变形菌、β变形菌、放线菌门、酸杆菌门等。

Candidate Phyla  Radiation

多种环境

Candidate Phyla Radiation

这是细菌中的一个主要群体,目前被认为由至少74个不同的门组成,对于这些门来说,可培养的代表微生物数量非常有限。

Most wanted taxa in  wastewater treatment plants

废水处理

多种门

它们对于市政和工业废水的净化(去除污染物)至关重要,并对提高污水处理厂的性能至关重要。这些细菌中全球分布最丰富和普遍存在的细菌包括β蛋白杆菌门、γ-变形杆菌和拟杆菌。

其他

Most-wanted  chemolithoautotrophic ‘spookmicrobes’

多种环境

多种门

通常认为这些来自各种分类学类别的微生物在全球甲烷、硫和氮循环中具有重要作用。它们还参与了最近发现的过程,包括完全氨氧化(comammox)和尚不清楚的过程,例如铁和锰依赖性的甲烷和氨氧化。

Candidatus Parakaryon  myojinensis’

深海热泉喷口

未知

这类微生物由没有分子数据的、未通过显微镜研究的稀有细胞为代表,其最大特点在于它既与原核生物和真核生物具有结构相似性,也有不同。



参考文献:

LewisW H , Tahon G , Geesink P , et al. Innovations to culturing the unculturedmicrobial majority[J]. Nature Reviews Microbiology, 2020.


原文链接:

https://doi.org/10.1038/s41579-020-00458-8


  

中国科学院生态环境研究中心

环境生物技术重点实验室

邓晔 研究员课题组发布

编译:鞠志成

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