临床肝胆肿瘤诊断主要分子标志物

一．临床应用的血清学分子标志物

(1)甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)

血清甲胎蛋白及其异质体AFP-L3是临床上应用最广泛和特异性最强的肝细胞癌标志物，国内常用于肝细胞癌患者的普查、早期诊断、术后监测和随访。化学发光免疫、酶联免疫吸附和电化学发光法是其临床常用的检测方式。对于甲胎蛋白≥400 ng/ml超过1个月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活动性肝病的患者，应高度考虑肝细胞癌，其诊断特异性高达99%，而敏感性仅为17%。对于甲胎蛋白阴性的患者，要定期检测和动态观察，并要借助影像学检查甚或穿刺活检等手段来明确诊断。AFP-L3在临床常用亲和吸附离心管法检测。

研究显示，在甲胎蛋白不升高的情况下，有34.3%的肝细胞癌患者，在确诊1年前即出现AFP-L3升高。当以10%为AFP-L3的临界值时，其对早期肝细胞癌的检测敏感性为22%～33%，特异性为93%～94%。对于甲胎蛋白阴性(<20 ng/ml)肝细胞癌患者，AFP-L3的检测敏感性为12%～21%,特异性为97%～98%。2005年，美国食品药品监督管理局批准将AFP-L3监测应用于肝细胞癌预警，并把AFP-L3≥10%作为诊断肝细胞癌的高特异性指标。

(2)脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)

DCP是一种不正常的凝血酶原分子。在肝细胞癌中，由于癌细胞不能正常合成凝血酶原前体，同时凝血酶原前体羧化不足，从而生成大量的DCP。目前广泛采用ELISA试剂盒来检测DCP，亦可采用电化学发光免疫法检测DCP。研究发现，DCP≥40 mAU/ml诊断早期肝细胞癌的敏感性和特异性分别为74%和86%。日本指南建议将DCP联合甲胎蛋白、AFP-L3作为肝细胞癌早期诊断和筛查的标志物。

(3)糖类抗原19-9

糖类抗原19-9蛋白是一种临床常用的肿瘤标志物，在正常的胆管、胰腺、胃和结肠上皮细胞中均有表达。上述部位的疾病均能引起糖类抗原19-9表达升高。其常用检测方法为微粒子酶免法(MEIA)和ELISA。糖类抗原19-9≥37 kU/L时，联合影像学诊断CCA的敏感性为77.4%，特异性为84.7%；糖类抗原19-9≥100 kU/L提示CCA患者预后不良；出现梗阻性黄疸症状时，糖类抗原19-9诊断特异性降低。胆道引流减黄后，患者糖类抗原19-9仍维持高值，提示胆管细胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)可能性大。糖类抗原19-9≥20 kU/L诊断胆囊癌的敏感性为50%，特异性为92.7%。

(4)癌胚抗原

癌胚抗原是一种参与细胞黏附的细胞表面糖蛋白，是结直肠癌的诊断标志，也是肺癌患者的预后标志物，在健康成人血液中难以检测到。因其易受吸烟等因素影响，故无法作为CCA的独立诊断或预后标志物。临床常用放射免疫检测或ELISA方法对血清癌胚抗原进行定量。癌胚抗原≥5 ng/ml时，诊断CCA的敏感性为33%，特异性为85%；癌胚抗原≥4 ng/ml时，诊断胆囊癌的敏感性为79.4%，特异性为79.2%。目前倾向推荐肿瘤标志物糖类抗原19-9联合癌胚抗原和糖类抗原125，以提高CCA鉴别诊断率(其中糖类抗原125≥35 kU/L)。

二．临床应用的病理组织学分子标志物

肝细胞癌的组织学分子标志物主要包括：肝细胞抗原(HepPar)-1、磷脂酰肌醇聚糖(GPC-3)、精氨酸酶-1、甲胎蛋白、低分子角蛋白(CK)8和CK18，其中HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和甲胎蛋白特异性较好，而CK7、CK19是正常小叶间胆管的标记物，因此可作为CCA的标记物。

在少数肝细胞癌中，CK19和CK7也可表达，而表达时则提示患者预后不良。在肝细胞癌的早期诊断方面，联合应用GPC-3、热休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶具有重要诊断价值。

这3个免疫标志物中2项阳性则考虑为肝细胞癌。CCA的主要组织学诊断标志物包括CK7、CK19、热休克蛋白70、黏蛋白-1。基于抗原-抗体免疫反应的免疫病理检测，并密切结合形态学，已成为PLC病理诊断与鉴别诊断的常规手段。

三．处于探索阶段的血清学分子标志物

(1)高尔基蛋白(GP)73

GP73是上皮细胞特异性的跨膜蛋白，在正常肝脏汇管区周围的胆管上皮细胞低表达，在大部分的正常肝细胞中不表达，在肝组织病变时表达上调。肝细胞癌患者外周血GP73水平更是明显升高。临床上常用ELISA方法检测GP73。当血清GP73≥10 U/ml(相对值)时，诊断肝细胞癌的敏感性为69%，特异性为75%。需要注意的是，GP73并不是一个肝细胞癌特异性标志物，它在肾细胞癌、前列腺癌中都有表达。同时，血清GP73升高不显著时，需与肝硬化相鉴别。

(2)磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)-3

GPC-3是一种细胞膜表面蛋白聚糖，参与多种细胞生物学过程，可用ELISA或放射免疫法检测。在乙型肝炎和丙型肝炎患者血清中，GPC-3≥300 ng/ml诊断肝细胞癌的敏感性为53%，特异性为77%。在患者肝细胞癌组织中，免疫组化检测GPC-3阳性时，诊断肝细胞癌的敏感性为97.7%，特异性为91.3%。

(3)循环肿瘤细胞DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)突变

ctDNA是肿瘤细胞释放到外周血中的游离DNA。应用ctDNA的特征性突变结合血清蛋白标志物检查，可以诊断出卵巢、肝脏、胃、胰腺、食道、结肠、肺或乳腺等8种常见肿瘤，检出阳性率的中位值为70%，其中肝细胞癌的阳性检出率达到96.1%。在不依赖临床信息的情况下，上述方法可以鉴定出44%肝细胞癌患者，联合临床信息检出率可达到63%。

另一项联合了ctDNA检查的肝细胞癌高频突变与血清中甲胎蛋白、DCP水平检测开发的"肝细胞癌筛查系统"，可以从乙肝表面抗原阳性的无症状慢性乙肝人群中筛查出肝细胞癌患者，其诊断敏感性85%，特异性93%，并有助于提前发现潜在的肝细胞癌患者，其诊断敏感性100%，特异性94%。

(4)ctDNA甲基化

DNA甲基化的改变与肿瘤发生、发展密切相关，且这种改变被认为发生在遗传学改变之前。外周血ctDNA的甲基化检测，是近年肿瘤另一种无创早期诊断方法。研究显示，对组织和外周血样本差异性甲基化位点结合临床特征所构建的诊断模型，对于鉴别肝细胞癌的敏感性达84.8%，特异性为93.1%，同时有助于预测肿瘤的分期、疗效和复发。在2019年欧洲肿瘤内科学年会上公布的一项大样本多中心临床试验显示，用肝细胞癌等20余种肿瘤及健康志愿者外周血甲基化测序后构建的肿瘤早筛预测模型，诊断肿瘤的总体特异性为99.4%，敏感性为54.7%。

(5)端粒酶逆转录酶(TERT)

TERT基因启动子区突变在大多数肿瘤中都存在。在胆囊癌中TERT启动子突变频率为9.1%；在肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, ECC)中出现的频率约为6.7%；在肝细胞癌中出现的频率约为0.5%～57.2%。TERT启动子区变异在低级别和高级别肝脏增生性结节中经常出现，被认为是肝细胞癌发生的早期分子事件，可作为潜在的辅助临床诊断标志物。

(6)微小RNA

微小RNA是由21－25个核苷酸构成的非编码小分子RNA，具有组织特异性、肿瘤特异性、可由外泌体途径分泌入血及稳定性强等特点，已被发现在肝细胞癌诊断和协同诊断中具有重要作用。血浆中检测到的微小RNA，包括微小RNA-122、192、21、223、26a、27a、801等，可鉴别诊断肝细胞癌，其曲线下面积为0.84～0.94。同时，微小RNA-26a在肝细胞癌组织中低表达的患者，可以在肝癌切除术后的干扰素辅助治疗中显著获益。

四、专家推荐意见

(1)建议使用血清学甲胎蛋白、AFP-L3以及DCP联合检测，结合患者影像学表现，作为临床肝细胞癌筛查、诊断的标志物。

(2)建议结合组织形态学，病理组织检测HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和甲胎蛋白，作为肝细胞癌病理诊断的免疫标志物；联合应用GPC-3、热休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶作为早期肝细胞癌临床病理诊断(3项免疫标志物中2项阳性)的免疫标志物；CK7、CK19和黏蛋白-1作为CCA临床病理诊断的免疫标志物。

(3)建议使用血清学糖类抗原19-9、125及癌胚抗原联合检测，结合影像学特点作为CCA临床诊断的标志物。

(4)建议使用血清学糖类抗原19-9检测，结合影像学特点作为胆囊癌临床诊断的标志物。

(5)ctDNA、微小RNA等血清学标志物，由于检测成本较高，且缺乏大规模临床试验结果论证，缺乏组织和肿瘤特异性特征，建议可作为肝胆肿瘤患者诊断及筛查的参考指标。

(6)建议肝胆肿瘤根治性治疗术后，参考使用上述血清学标志物结合影像学检查进行动态监测。