科普丨CRISPR的发现故事

CRISPR的故事始于1987年。当Nakata和他的同事在研究大肠杆菌iap基因时，发现在它的下游含有一组29 nt的重复序列，但这些重复序列与典型的重复形式不同，即在这种重复序列中间含有32 nt的非重复序列¹。但是，最初并不知道这些重复序列的功能。在接下来的10年中，人们在越来越多的微生物中发现了这种结构的序列；Mojica和他的同事总结了所有测序的微生物，发现超过40%的细菌和90%的古生菌含有类似结构的序列²。

2002年，在这种结构的重复序列附近，发现还有名为CRISPR-associated（Cas）的特征基因，根据此Cas蛋白的差异对CRISPR系统进行了分类（typeI-III）³。Type I和III的CRISPR基因座中，包含多个Cas蛋白，现在我们知道这些蛋白与crRNA形成蛋白复合体，用于识别并切割靶标序列，而typeII系统的Cas数目很少。虽然已有很多CRISPR在基因组上被注释，但实际上其具体的生物学意义仍是未知的。

直到2005年，经过系统分析后发现间隔序列（spacer）可能是来源于外源染色体和相关噬菌体的序列⁴。另外，有研究发现病毒不能感染某些古生菌，这些古生菌的spacer来源于病毒的DNA片段⁴。这些证据使得人们推测，CRISPR具有免疫记忆和防御的功能，spacer通过核酸碱基配对的方式预防侵染的噬菌体^{4, 5}。

2007年，食品公司Danisco对嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的type II CRISPR系统研究发现，Cas蛋白控制spacer的获取并且整合到基因组上，这个spacer可以特异性靶向再次侵染的噬菌体基因组⁶。随后，来自大肠杆菌的type I系统的研究表明，其中的crRNA具有引导Cas内切酶活性的作用⁷。同年，在来自表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的type III系统中证实，Cas酶的活性作用于DNA而不是RNA⁸。

2011年，Siksnys和他的同事第一次证实了type IICRISPR系统可以从嗜热链球菌中转移到大肠杆菌⁹。随后的2012年，Charpentier/Doudna和Siksnys独立在体外证实了Cas9（分别来源Streptococcus thermophilus和Streptococcus pyogenes）能在体外进行切割，而且单个RNA（sgRNA）即crRNA和tracrRNA融合的形式同样可以在体外发挥活性^{10, 11}。

2013年，张锋和George Church两个实验室分别应用Streptococcus thermophilus和Streptococcus pyogenes来源的type II系统Cas9成功地在哺乳动物细胞中进行基因组编辑^{12, 13}。在此之后，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术受到了广泛的研究和应用，并且发展出了许多基于Cas9的应用工具^14-19。

2015年，张锋实验室鉴定了来自2类V型系统的Cas12a（旧称Cpf1）同样可以用于细胞的基因组编辑，但仅需要crRNA的引导²⁰；2016年，同样在张锋实验室鉴定了2类VI型系统的Cas13a（旧称C2c2），这是一种RNA引导的RNA特异性切割核酸酶²¹。Cas12a和Cas13a在特性上与Cas9的差异，为开发CRISPR工具箱提供了新的可能。

参考文献：

1 Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, NakataA. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphataseisozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.J Bacteriol 1987; 169:5429-5433.

2 Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Soria E, Juez G.Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomesof Archaea, Bacteria and mitochondria.MolMicrobiol 2000; 36:244-246.

3 Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 2002; 43:1565-1575.

4 Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J,Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derivefrom foreign genetic elements. J Mol Evol2005;60:174-182.

5 Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elementsin Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophageDNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 2005; 151:653-663.

6 Barrangou R, Fremaux C, Deveau H et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses inprokaryotes. Science 2007; 315:1709-1712.

7 Brouns SJ, Jore MM, Lundgren M et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science 2008; 321:960-964.

8 Marraffini LA, Sontheimer EJ. CRISPR interferencelimits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science 2008; 322:1843-1845.

9 Sapranauskas R, Gasiunas G, Fremaux C, Barrangou R,Horvath P, Siksnys V. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system providesimmunity in Escherichia coli.NucleicAcids Res 2011; 39:9275-9282.

10 Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V.Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage foradaptive immunity in bacteria. Proc NatlAcad Sci U S A2012; 109:E2579-2586.

11 Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, DoudnaJA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012;337:816-821.

12 Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarloJE. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013; 339.

13 Cong L, Ran FA, Cox D et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 2013; 339:819-823.

14 Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development andapplications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 2014; 157:1262-1278.

15 Doudna JA, Charpentier E. The new frontier ofgenome engineering with CRISPR-Cas9.Science2014; 346:1077-+.

16 Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems forediting, regulating and targeting genomes. NatureBiotechnology 2014; 32:347-355.

17 Mali P, Esvelt KM, Church GM. Cas9 as a versatiletool for engineering biology. Nat Methods2013; 10:957-963.

18 Wang HF, La Russa M, Qi LS. CRISPR/Cas9 in GenomeEditing and Beyond. Annual Review ofBiochemistry, Vol 85 2016; 85:227-264.

19 Sternberg SH, Doudna JA. Expanding the Biologist'sToolkit with CRISPR-Cas9. Mol Cell2015; 58:568-574.

20 Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO et al. Cpf1 is a single RNA-guidedendonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 2015; 163:759-771.

21 Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S et al. C2c2 is a single-componentprogrammable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 2016;353:aaf5573.